Мікроорганізми в біотехнології

    Властивість акумулювати в середовищі для  культивування амінокислоти виявлена у багатьох мікроорганізмів. Відносяться  вони до різних таксономічних груп. Серед культур, що являються потенційними продуцентами глутамінової кислоти, виявлено 20% бактерій (з 650 досліджених), 30% стрептоміцетів (з 372), 30% дріжджів (з 468) і 10% мікроскопічних грибів (з 475) [10].

    Більшість досліджених штамів мікроорганізмів, незалежно від їхньої видової приналежності, переважно накопичують α-аланін і глутамінову кислоту. Значно менше штамів і в меншій кількості виділяють аспарагінову кислоту, лейцин, валін, ізолейцин, лізин [1]. Строгої кореляції між видовою приналежністю організму і його властивості накопичувати амінокислоти немає [10].

    Серед продуцентів амінокислот - різні  мікроорганізми представники родів Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter, Microbacterium, Eschirichia. Використовувані в промисловості мікроорганізми можна підрозділити на декілька класів: дикі штами, ауксотрофні мутанти, регуляторні мутанти і ауксотрофні регуляторні мутанти. Промислові штами, як правило, несуть декілька мутацій, що використовують механізми регуляції цільової амінокислоти і її попередників [11].

    Мікроорганізми  зазвичай синтезують кожну амінокислоту в визначеній кількості, це пояснюється  контролем як на рівні генів біосинтезу кожної амінокислоти, так і рівні  ферментів. Такий контроль виключає пере продукування амінокислот, і виділення  їх з клітини можливе лише в у мікроорганізмів з порушеною системою регуляції [5]. В природних умовах та порушення достатньо  рідкісні, тому для отримання промислових продуцентів довелося йти по шляху отримання мутантів, що мають генетичний дефект регуляторного контролю процесу біосинтезу потрібних  амінокислот [13].

    L - глутамінова кислота - перша амінокислота, отримана на основі промислового мікробіологічного синтезу.  В якості продуцентів брали дикі штами глутаматпродукуючих коринебактерій [12].  Найбільш поширеними продуцентами глутамінової кислоти являються штами бактеріальних культур Corynebacterium glutamicum і Brevibacterium flavum [14].

    Одним з перших методів мікробіологічного  синтезу глутамінової кислоти був  метод ферментативної трансформації 2-кетоглутарової кислоти, метод, що використовує високу глутаматдегідрогеназну активність деяких мікроорганізмів, зокрема Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens та інших [1].

    В інституті мікробіології  вченими  розроблена технологія отримання глутамінової кислоти з використанням мутанта Corynebacterium glutamicum 541 Р [14].

    Деякі продуценти, наприклад Corynebacterium glutamicum, можуть при зміні умов культивування накопичувати L-глутамін, який, можливо, утворюється з глутамінової кислоти [1].  

    Corynebacterium glutamicum. Група 20. Неспороутворюючі грампозитивні палички неправильної форми [15].

    Прямі чи злегка вигнуті палички з загостреними чи іноді булавовидними кінцями, 0,3-0,8х1,5-8,0 мкм. Нерухомі, кислотонестійкі, факультативні анаероби. Потребують багатих поживних середовищ, метаболізм бродильного типу, каталазо позитивні [16].

    У коринебактерій здатність забарвлюватись за Грамом може змінюватись з віком  культури. Встановлено, що природна дисоціація культур за цією ознакою дорівнює 0-0,1% загальної кількості клітин, тоді як при культивуванні на середовищі з ПАР -0,3-100%. Також процес вирощування коринебактерій на середовищах з ПАР супроводжується зміною антигенних властивостей і антибіотикочутливості досліджуваних штамів [17].

    Brevibacterium flavum. Група 20. В молодих культурах палочки неправильної форми, 0,6-1,2х1,5-6 мкм, одиночні чи в парах. Може зустрічатись розгалуження але міцелій не утворюється. Грампозитивні, облігатні аероби, каталазопозитивні. Широко поширені в молочних продуктах [16]. Можуть рости на м’яких  сирах, володіють незначною протеолітичною активністю [18].

    Bacillus subtilis. Група 18. Прямі палочки , 0,5-2,5х1,2-10 мкм, з закругленими кінцями. Грампозитивні, рухомі, споро утворюючі , аероби, хемоорганотрофи, каталазо позитивні [16].

    Pseudomonas fluorescens..Прямі чи злегка вигнуті, але не спіральні палички, 0,5-1,0х1,5-5,0 мкм. Рухомі за рахунок полярних джгутиків, аероби, метаболізм чисто дихального типу з використанням кисню в якості кінцевого донора електронів [18].

    Для виробництва аланіну використовують представників роду Corynebacterium і Brevibacterium, а саме Corynebacterium gelatinosum i Brevibacterium amylolyticum [14].

    Продуценти  лізину – глутаматпродукуючі коринебактерії Corynebacterium glutamicum і Brevibacterium flavum- мають єдину амінокислоту, активність якої регулюється шляхом узгодженого інгібування по принципу оборотного зв’язку треоніном і лізином. Синтез треоніну залежить від активності гомосериндегідрогенази,  лізину-каталізується дигідроколінат синтетазою [12].

    Мікробіологічний синтез L-триптофану здійснюють на основі штамів мутантів дріжджів (Candida) і бактерій (Escherichia coli, Bacillus subtilis), дефіцитних по Тирозину і фенілаланіну. Промисловий синтез L-триптофану здійснюється на основі сахарів [11].  
 

    3.2 Органічні кислоти 
 

    Органічні кислоти широко використовують в  харчовій і фармацевтичній промисловості, в техніці і як хімічна сировина. Більше 50 органічних кислот можуть бути отримані на основі мікробіологічного синтезу. Біотехнологічні методи їх отримання на теперішній час детально розроблені. Більш того,прийнято вважати, що органічні кислоти,отримані в результаті мікробіологічного синтезу, кращі для використання людиною, в порівнянні з синтетичними кислотами [1].

    Харчові кислоти раніше, в обмеженій кількості, виділяли із природних джерел, лимонну кислоту – із соку лимонів, винну – із винного каменю. Зараз мікробіологічне отримання органічних кислот базується на аеробному бродінні [11]. В залежності від кінцевих чи переважаючих продуктів розрізняють спиртове, молочнокисле, маслянокисле, ацетонобутилове та інші види бродінь. В результаті неповних окиснень утворюються оцтова, лимонна, глюконова, ітаконова і ряд інших кислот [10].

    Кислоти, методи отримання яких розроблені достатньо  детально, приводяться в табл. 1. На теперішній час в промислових масштабах  мікробіологічним шляхом синтезується тільки 6 кислот: лимонна, глюконова, ітаконова, 2 – кетоглюконова , оцтова та молочна [1]. 
 

    3.2.1 Продуценти органічних кислот 
 

    Властивість продукувати органічні кислоти  при рості на середовищах з вуглеводами широко розповсюджена серед міциальних грибів родів Aspergillus (Aspergillus awamori, Aspergillus clavatus, Aspergillus fumaricus, Aspergillus itaconicus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus aterreus, Aspergillus awentil), Penicillium (Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinium, Penicillium citrogenum, Penicillium tutenum) i Rhizopus (Rhizopus nigricans, Rhizopus oryzae) [1].

    Також, як продуценти використовують бактеріальні дріжджові і грибні культури Lactobacillus, Arthrobacter, Alcaligenes, Candida, Trichoderma [11].

    Глюконову кислоту найчастіше отримують використовуючи гриби родів Aspergillus і Penicillium. Продуценти глюконової кислоти містять активний фермент – глюкозооксидозу, що каталізує окиснення альдегідної групи в молекулі глюкози [4].

    Продуцентами  фумарової кислоти можуть бути різні  види грибів: Penicillium griseofulvum, Aspergillus glaucus, Aspergillus flavus, Aspergillus onici, Caldariomyces fumago. Найбільш активно продукують фумаролу кислоту мукорові гриби, особливо ті,що відносяться до роду Rhizopus [1].

    Цінним  вихідним матеріалом для виробництва синтетичного нітронного волокна є ітаконова кислота. На експериментальному заводі біохімічних препаратів інституту мікробіології в Латвії було розроблено технологію отримання ітаконової кислоти із сахарози за допомогою культури Aspergillus terreus [4].

    Основні продуценти органічних кислот наведені а таблиці 3.2.1.1 

    Таблиця 3.2.1.1 – Основні органічні кислоти, що продукуються мікроорганізмами [1]

    3.2.2 Продуценти лимонної кислоти 
 

    У промисловому виробництві лимонної кислоти як продуцент в основному використовують Aspergillus niger, але також застосовують і A. Wentii [11]. Штами, що використовуються в промисловості характеризуються великою швидкістю росту, легкістю культивування і високим виходом цільового продукту [1].

    Aspergillus niger належить до класу дейтероміцетів, або недосконалих грибів (Deuteromycetes або Fungi imperfecti), порядку Hyphomycetales [19]. Розмножується як вегетативно, так і за допомогою спор, які утворюються на кінці виростів конідієносців – стеригм в вигляді прямих ланцюжків [4]. Статевого розмноження немає ,тому можна сказати, що недосконалі гриби – конідіальна стадія аскоміцетів, у яких стадія асків ще не виявлена або ж втрачена в процесі еволюції [18]. Конідієносці  Aspergillus утворюються із вегетативних клітин міцелію в вигляді прямих вертикальних, нерозгалужених гіф, що мають на кінці пухирець. Потрапивши на поживне середовище , спора проростає і утворює виріст – гіф, який продовжує рости, розгалужуватись, переплітатись, утворюючи міцелій [4].

    Мікрофлора, що супроводжує продукування грибом Aspergillus niger лимонної кислоти,знижує його властивість до синтезу, прямо до повного його подавлення. Антагоністами являються інші гриби:дріжджові та плісняві [20].

    Деякі бактерії – Bacillus licheniformis, Bas subtilis, Bravibacterium flavum, Arthrobacter paraffineus, можуть утворювати лимонну кислоту при рості в середовищі з глюкозою, ізоцитратом чи вуглеводами. Бактерії в цьому плані ще мало вивчені, але представляють практичний інтерес як продуценти лимонної кислоти, так як ростуть швидше, ніж гриби, і використовують більше різних субстратів при утворенні цитрату [21]. 
 

    3.2.3 Продуценти молочної кислоти 
 

    В промисловості молочну кислоту  отримують , використовуючи  Lactobacillus delbrueckii, термофільні з оптимумом температури розвитку 45⁰ – 50⁰ С [4]. Належать до 19 групи, грампозитивні палички, правильної форми, зазвичай в коротких ланцюжках. Спор не утворюють, факультативні анаероби, потребують багатих і складних середовищ, каталазо негативні , не містять цитохромів [16].

    Зараз ведуться дослідження щодо можливості регуляції росту лактобактерій фізичними методами in vitro, а саме за допомогою нового приладу – комплексу медичного експертного (КМЕ) та апарату “CEM Tech”. Було встановлено,що максимальні відходи біомаси для штаму Lactobacillus delbrueckii – 146% при висіванні лактобактерій, “прокачених” маркерами та аутоспектрами відповідного штаму, на “непрокачене” поживне середовище. Показана можливість регуляції (стимуляції/ пригнічення) росту клітин молочнокислих бактерій роду Lactobacillus фізичними методами за допомогою КМЕ (обробка клітин і поживного середовища спектрально динамічними характеристиками) і про дії апарату “CEM Tech” (вплив електромагнітного випромінювання кристалів арсеніду галію на поживне середовище і клітини бактерій). Не виявлено значних змін в морфологічних признаках під дією вивчених фізичних методів [22].