Микробтар генетикасы

Транскрипция промотор және терминатормен реттеледі. Промотор - бұл РНҚ-полимераза ферментімен тығыз байланысатын ДНҚ-ның қысқа фрагменті. Ол ферменттің ДНҚ-матрицасы бойымен қозғалуына ықпал жасайды да, құрылымдық ген басының алдында орналасқан ДНҚ-ның кодтаушы тізбегінің нүктесінде транскрипция процесін инициациялайды. ДНҚ-ның терминатор деген болігі құрылымдық ген соңында орналасып, транскрипция аяқталуының сигналы болып табылады. Промотор мен құрылымдық ген аралығында ДНҚ-ның оператор деген тагы бір бөлігі орналасқан. Ол клеткада метаболизмнің артық концентрациясы жиналғанда арнайы ақуыз-репрессормен байланысып, транскрипция процесін тоқтатады.

         Рибосомадағы ақуыз трансляциясын  реттеуін мРНҚ түзілуі кезінде  транскрипцияланған басқа тізбектер  жүзеге асырады. Рибосомалардың  мРНҚ-ның рибосомамен байланысуына  жауапты арнайы бөлігіне жалғасуының  арқасында трансляция старттық  сигналдан - кұрылымдық геннің  бірінші кодонынан басталады.  Ген соңындағы "стоп кодон"  синтезделетін ақуыздық молекуланың  толықтай босануына жағдай жасайды.  Кодтаушы бөліктегі өзгерулер  ферменттің амин қышқылдық тізбегін  өзгертіп, оның белсенділігіне эсер  етуі мүмкін. Промотор тізбектеріндегі  аз ғана өзгерулер оның РНҚ-полимеразамен  байланысу мүмкіншілігін арттырып  транскрипцияны жылдамдатуы мүмкін. Оператор мен ген-реттеуші аймағындағы  мутация репрессордың байланысуына  кедергі жасау мүмкін. Нәтижесінде  транскрипция нәтижелігін арттырады.  Басқа организмдерге көшірілген  тендер промотор мен рибосомамен  байланысу аймағы құрылымдық  бойынша сәйкес келсе, экспрессияланады.

        Генетикалық  код және транскрипция мен  трансляцияньщ негізгі биохимиялық  реакциялары прокариоттық және  эукариоттық клеткаларда "бірдей. Бірақ, эукариоттардың қүрылымдық  гендерінде кодтаушы аймақтар (экзондар) арасында кодтамайтын аймақтар  − интрондар орналасқан. Интрондар  экзондармен бірге транскрипцияланады, бірақ экспрессияланбайды.

     Интрондарды  қиып тастап экзондарды біріктіру  процесі сплайсинг деп аталады.  Сплайсинг нәтижесінде жетілген  мРНҚ түзіледі. Одан белок трансляцияланады. Интрондардың болуы прокариоттык  клеткаларда рекомбинанттық ДНҚ  экспрессиясын қиында-тады. Өйткені  бактерияларда сплайсинг процесін  жүргізетін ферменттер жоқ. Табиғи  эукариоттық ген прокариоттық  жүйеде экспрессиялану үшін алдын-ала  интрондардан босатылу керек.  мРНҚ-ға кері тарнскриптаза ферменті  көмегімен ДНҚ-ң комплёментарлы тізбегі (кДНҚ) репликацияланады. Кейін ДНҚ-полимераза ферменті арқылы ДНҚ-ның екінші тізбегі түзіледі. Бөтен ген осылайша клеткареципиентте экспрессияланады.

     Вирустардың,  прокариоттық клетка геномы қүрылымы  бойынша өсімдіктер мен жануарлар  геномдарымен салыстырғанда қарапайым,  өте күрделі емес. Сондықтан, гендік  инженерияда вирустар немесе  бактериялар гендерін қолданғанда  оларды бөліп алу айтарлықтай  қиындықтар тудырмайды. Ал адам  организмінің көптеген тендер  жинағы арасынан керекті генді  табу мен бөліп алу өте қиын. Сондыктан эукариоттық клеткада  керекті геннен транскрипцияланған  мРНҚ идентификациялау жүргізу  жеңілірек. Жануарлар клеткаларында  мРНҚ транскрипииясы клеткалық  ядрода жүзеге асады; ядродан  цитоплазмаға генетикалық ақпаратты  матрицалық РНҚ тасымалдайды, рибосомаларда  ақуыз трансляциясы жүріп жатады. Прокариотты клеткаларда қалыптасқан  ядролары болмайды, транскрипция  және трансляция үрдістері параллель  жүріп отырады, ал мРНҚ тура  рибосомалармен байланысады.

     Жоғарыда айтылған  транскрипция және трансляция  үрдістерінің кейбір ерекшеліктері,  генетикальщ ақпараттың іске  асу механизмі негізінде рекомбинантты  ДНҚ технологиясы жатады. Рекомбинантты  ДНҚ технологиясы келесіде: алдымен  донор клет-касынан нативті ДНҚ  бөліп алынады (клонданатын ДНҚ,  енетін ДНҚ, ДНҚ-нысана, бөтен  ДНҚ), кейін рестриктаза ферменті  көмегімен белгіленген сайтта  ажыратады және босатылған генді  (тендер) лигаза ферменті қатысуымен  ДНҚ тасымалдайтын вектормен  байланыстырады (клонданатын вектор), яғни in vitro рекомбинантты ДНҚ молекуласын  алуға болады 

    Осылай конструкцияланған рекомбинантты ДНҚ реципиент клеткасына енгізеді.

   Бірінші этап - баска организмге тасымалдайтын генді (гендер ді) бөліп алу: а) донор ДНҚ-нан оны рестрикциялау, белгілі нуклеоидты катары бар ДНҚ бөліктің эндонуклеаза рестрикциялайтын ферментімен кесіп алу. Осы кезде ДНҚ екі спиральді жібі жазылатын жағынай ыдырайды, "табалдырық" пайда болады - ДНҚ бір жібі бірнеше нуклеотидтерге бөлінеді. Бір жіпті (жабысқақ) шеттері пайда болады. Егер бір түрлі рестриктаза бөлген 2 жабысқақ ДНҚ фрагменті кездесетін болса, қатарлар шеттері комплементарлы болғандықтан жеңіл бір-бірімен өзара байланысады.

        Шеті  жабысқак нуклеотидті қатар болуы  мүмкін: 1) алғашында сол рестриктазамен  өнделген вектормен қосылады  және 2) сызықты молекуладан комплементарлы  шеттерін өзара байланыстыра  тігіп, сақиналы түрге ауыстыру. Бірақ, бұл процедура киын емес, егер бірнеше мың тендер бар  бактериялар туралы немесе бірнеше ондық гендері бар вирустар туралы сөз болса. Ал жануарлар клет-касы геномынан (бірнеше миллиондаған гендері бар) нақты мақ-сатты генді бөліп алуға болады:

б) қысқа тізбекті ДНҚ фрагменттерінің (олигонуклеотидтерін) химиялық синтезі әдісін қолданып, нуклеотидтер арасында эфирлі байланыстар түзілген соң ДНҚ лигаза көмегімен олигонуклеотидтер бір-бірімен тігіліп тізбекті полинуклеотидтерді алу;

в) донор клеткасынан ДНҚ фрагменті емес, одан транскрипцияланған мРНҚ бөліп алу - бұл жиі қолданатын әдіс. мРНҚ негі-зінде кері траскриптаза ферменті (ревертаза) көмегімен компле

ментарлы ДНҚ (кДНҚ) жібі синтезделінеді, әрі қарай ДНҚ-полимераза ферменті қатысуымен кДНҚ екінші жібі қүрастырылады;сөйтіп басқа организмге тасымалдайтын ген алынады.

Екінші этап. Донор клеткасынан бөлінген ген нақты құрылымды ақуыз туралы информацияға ие, бірақ өз бетімен клетка-реципиентте іске асыра алмайды. Осы жаңа генді баска организмдерге ендіріп және оның репликациясын қамтамасыз ететін қосымша ДНҚ молекуласы қажет. Осындай генетикалық ақпаратты тасы-малдаушысы (вектор) ретінде плазмидалар, жануарлар вирустары мен бактериофагтарды қолдануға болады. Трансгенді өсімдіктер алуына қолданатын типті вектор Agrobacterium tumefaciens топы-рақ бактериясынан бөлінген Ті-плазмида. Agrobacterium tumefaciens бактериясымен өсімдіктер симбиозды өзара қарым-қатынасқа түседі, Ті-плазмида өсімдік клеткасына трансформациясы барысында "тамырлық жаңғақша - корончатый галл" ауруын тудыратын Т-ДНҚ геномын ендіреді.

Алдымен бөліп алган генді  вектормен қосу in vitro пробиркада жүргізіледі, вектордың сақиналы молекуласын  рестриктазамен кеседі, "жабысқақ" шеттері пайда болады, оларға лигаза көмегімен ауыстырылатын геннің "жабысқақ" шетімен біріктіреді. Осылай рекомбинантты ДНҚ конструкциясы  жасалынады, оны әрі қарай реципиент  клеткасына ендіреді.

      Нысаналы  генді тасымалдау қабілеттілігімен  қоса векторда генетикалық маркерлер  болуға тиісті (жиі бүл нақты  антибиотиктерге төзімділік - оны  селективті қоректік ортаға себу  қорытындысы бойынша анықтайды), онда рестрикция сайттарының  саны көп болуға тиісті (спецификалық  рестриктазамен кесіп алатьш  вектор-дың ДНҚ сақиналы молекуласының  бөліктері). Векторда репли-кацияны  бастайтын бөлік - "оrі" болуы  тиіс. Айта кету керек, өкінішке  орай плазмидалар вектордың барлық  белгілерін үстанбайды, сондықтан  оларға алдын-ала жоспарланған  қасиетті конструкциялайды.

    Дегенмен, вектор  ретінде плазмидаларды жиі қолдануы  олардың жоғары коньюгативтілігінде  (реципиент клеткасына ену қабілеттілігі). Олар бактериялар клеткасыньң  табиғи құрылымдық компоненті, цитоплазмада  ДНҚ сақиналы молекуласы түрінде  орналасады. Автономды репликацияланады, себебі оның қүрамында репликацияны  бастайтын сайты (ori) бар, бактериялардың  зат алмасуына қатысады, фенотиптік  ондай-мұндай белгілерін айқындатады.

Үшінші этап. Конструкцияланған рекомбинантты ДНҚ реципиент клеткасына ендіреді, түрақты қадағаланады, яғни репликацияланып келесі үрпақтарына ауысып отырады. Трансформацияның нәтижелілігі реципиент клеткасыньщ компетенттілігіне, вектордың экспрессиялаушы белсенділіге, донор мен реципиенттіц генетикалық материалы туысты жақындықта болуына тәуелді.

    Клеткада рекомбинантты  ДНҚ жақсы трансформациялануы  үшін протопласт алынады, реципиент  клеткасына жылумен эсер етеді,  клетка мембранасы еткізгіштігін  жоғарлату үшін СаСІ, ерітіндісі: қосылады. Экспериментте байғалған. 1000 клеткалардан трансформацияға  1-2 клетка үшырайды. Одан кейін  осы клеткалардағы ендірілген  рекомбинантты ДНҚ клетка иесі  рестриктазаларынан қорғау керек,  олар бөтен ДНҚ деградацияға  ұшыратып, ыдыратуы мүмкін.

     Клеткаға рекомбинантты  ДНҚ ендірілген соң оның экспрес-сиясы  жүреді (транскрипция және трансляция). Микробтық клеткаға енген бөтен  геннің транскрипциясы жүреді, егер  осы ген ал-дында клетка иесінің  РНҚ-полимеразаны танитын күшті  промотор болған жағдайда ғана. РНҚ полимераза транскрипцияны  детерми-нациялайды, ал мРНК рибосомада  бөтен ақуыздың синтезін трансляциялайды.  Осы жерде де синтезделетін  ақуыз клетканың протеазаларымен  бедсенді деградацияға үшырамауын  қадағалау қажет, яғни клондалған  клеткаларда соңғыларды тежеу  міндетті.

          Айтарлықтай өзекті мәселелеріне  жатады - модификацияланған микроорганизмдер  клонын түрақтандыру қиыншылығы, себебі микроорганизмдер үрпақтан  келесі үрпақка ауысьш отырғанда  кейбір клондар рекомбинантты  гендері бар плазмидалардан айырылып  қалады. Осындай плазмидалары жоқ  клеткалар плазмидасы барларымен  салыстырғанда өте жылдам өседі,  көбейеді. Соңында популяцияда плазмидасыз  микроорганизмдер варианттары басым  болады.

     Рекомбинантты  ДНҚ технологиясының мақсатын  керсехетін түрлі анықтамалар  бар, соның бірі "химиялық микрохирургияға"  тенестіру, онда микроскальпель  ретінде келесі топтағы ферменттер  технологияны жүзеге асырады:

     - ДНҚ молекуласын  белгілі сайттарда ұсақ фрагменттерге  бөлетін ферменттер. Рестрикциялайтын  эндонуклеазалардың үш типі анықталған (1, II, III). Генетикалық инженерияда  негізінен II типтегі рестриктазалар  қолданады, себебі олар нуклеотидтік  қатардың нақты қажетті бөліктің  ДНҚ танып, оны ажыратады; әрі  қарай оны кесіп "жабысқақ" шеттерімен вектор ДНҚ біріктіреді.  Танып алу және боліп алу  сайттары бойынша рестриктазалардың  специ-фикасы күшті, бірнеше жүздері  анықталған;

- мРНҚ-да комплементарлы ДНҚ жібін (кДНҚ) синтездейтін фермент, РНҚ-тәуелді ДНҚ-полимераза немесе ревертаза деп атайды;                -ДНҚ екінші жібін қүрастыруға қатысатын фермент, 5/-3/ ба-ғытта комплементарлы нуклеотидтерді қосу арқылы ДНҚ тізбегін ұзарту жолммен іске асады, бүл ДНҚ-полимераза;

- Кесілген ДНҚ фрагментін сақиналы жіпке біріктіретін фермент - бұл лигазалар;

- Бөтен ДНҚ молекуласының немесе трансляция өткен соң мРНҚ деградациясына әкелетін нуклеин қышқылдарда гидролиз реакциясын катализдейтін фермент - бұл нуклеазалар.

Генетикалық код

         Генетикалық код — тірі организмдерге тән нуклеин қышқылдары молекуласындағы тұқым қуалаушы (генетикалық) ақпараттың нуклеотидтер тізбегі түріндегі біртұтас “жазылу” жүйесі. Бұл — барлық тірі организмдерге ортақ заңдылық.

         Генетикалық код туралы қазіргі  қалыптасқан көзқарасқа 1960 жылы Америка ғалымдары М. Ниренберг, Г. Корана және П. Ледердің жүргізген зерттеулері көп әсерін тигізді. Генетикалық код бірлігі — ДНҚ мен РНҚ молекуласындағы 3 нуклеотид (триплет) тізбектерінен тұратын кодон (аРНҚ нуклеотидтерінің триплеттері) болып табылады. Гендегі кодондар тізбегі осы генді “жазатын” (кодтайтын) белоктағы амин қышқылдар тізбегін анықтайды. Клеткадағы генетикалық код екі сатыда іске асады:

1. транскрипция сатысы ядрода жүреді және ДНҚ-ның сәйкес бөліктерінде ақпараттық (информациялық) рибонуклеин қышқылдарының молекулалары (аРНҚ) жасалады. Сонымен қатар, ДНҚ нуклеотидтер тізбегі аРНҚ нуклеотидтер тізбегі ретінде қайта жазылады;
2. трансляция сатысы цитоплазмада, белок синтезделетін рибосомада жүреді. Сондай-ақ, аРНҚ нуклеотидтер тізбегі, полипептидтер құрайтын амин қышқылдар қалдықтарының белгілі бір тізбегіне көшеді.

       Генетикалық  кодтың бір ерекшелігі, әмбебап  екендігі, яғни барлық организмдерде  белгілі бір 3 нуклеотид (триплет) белгілі бір амин қышқылдарын “жазады” (кодтайды). Бір амин қышқылы бірнеше триплетпен “жазылуы” (кодталуы) мүмкін. Кодондар арасында “үтір” болмайды, яғни олар бір-бірінен бөлінбеген. Ол бір геннің аймағында белгіленген нүктеден бастап, бір бағытта есептелінеді. 64 кодонның 61-і белок құрайтын 20 амин қышқылдарын “жазады” (кодтайды), ал қалған үш “нонсенс” (мағынасыз) кодондар (УАГ, УАА және УГА) полипептид синтезін аяқтайтын “нүкте” қызметін атқарады. Олар белок биосинтезінінің аяқталғанын білдіреді.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Пайдаланылған әдебиеттер: