Селекция (сұрыптау)
дегеніміз - қажетті метаболитті
жоғары синтездеу белсенділігіне
ие және өнім биосинтезінің
көлемін бірнеше кезеңдік мутагенезде
кеп қайтара көбейту (ондаған
және жүз есе) қасиетіне ие
жабайы штамдарды сұрыптау.
Белгілі бір
қасиеттеріне байланысты (биопродуцирлеуші,
био-деградациялаушы және т.б.) биобелсенді
қасиетке ие микроорганизмдер
штамын қалай сұрыптайды? Мысалы,
көмірсутектіні тотықтыратын микроорганизмдерді
- автожанармай бекеті топырағынаң
мұнай өнімдерімен ластанған
территорияларда; шарап ашытқыларын
- жүзім алқабында, басқа жеміс-жидек
өсімдіктерінде; сүт қышқылды микроорганизмдерін
- сүт өнімдерінде және т.б.
яғни тіршілік етуге қажетті
жағдай және субстраты бар
жерде болады. Көбінесе ізденістерді
микроорганизмдер үшін табиғи
эко-орындарда, биоценоздарда жүргізеді.
Өндіріске құнды
микроорганизмдерді коллекциялық
дақылдар арасынан таңдалынып
алынады. Өйткені микроорганизмдер
коллекциясы құрылып, көптеген
жылдар тіршілікке қабілетті
жүздеген, мыңдаған микроорганизмдер
штамдары сақталуда.
Таңдап алынған
микроорганизмдердің таза дақылын
бөліп алады, және олардьщ ішінен
қажетті метаболитті шектен тыс
көп өндіретіндерін әрі қарай
мутагенді әсерге үшыратады.
Алғаш рет 1927
жылы рентген сәулесімен өндеген
микроорганизмдердің индуцирленген
мутациясын алған. Рентген сәулесінен
басқа әртүрлі химиялық және
физикалық мутагендер әсермен
ДНҚ қүрылымын өзгертуге болады.
Селекциялық микроорганизм
штамын рет-ретімен физикалық
және химиялық мутагендер әсеріне
ықпал жасайды. Әрбір эсер еткен
соң мутацияланған ең жақсы штамдарын
сүрыптап алынып отырады, олардың биоөндіруші
қабілеттілігін тұрақтандырады, субстратпен
қоректендіруді ыңтайлы көрсеткішке жеткізеді
және келесі кезеңде басқа мутагенмен
немесе екеуін біріктіріп эсер етеді.
Мысалға, жиырма жылдан
астам үздіксіз 21 циклді мутагенез
және сұрьштау жүргізіп, ғалымдар
пенициллин өнімін 55 есе жоғарлатты
(рентген, УК сэуле, ипри;), 60 мг-нан
7 г/л-ге лейін. Жұмысты әрі қарай
тоқтатпастан сұрыптау жүмыстары
РепісіШит биопродуцирлеуші белсендігін
20 г/л-ге дейін жеткізіп, 1941 жылы
Флори мен Чейн алған антибиотик
өнімінен бірнеше жүз есе арттырды.
Мүндай жақсы жетістік үзбей
ұзақ сұрыптау үрдістеріне қарамастан
антибиотик түзуші микроорганизмдер
ішінен әрдайым орын ала бермейді.
Себебі антибиотиктер екіншілік
метаболиттер болғандықтан және
тікелей трансляция өніміне жатпайды.
Әдетте, антибиотиктер биосинтезіне
бірнеше ондаған тиісті ферменттерін
кодтаушы құрылымдық тендер қатысады.
Сол себепті мутациялық эсер
ферменттер биосинтезіне сәйкес
гендердің активтігін біртіндеп
өзгертіп, қайтадан қарастырып отыруы
қажет.
Жабайы штамнан
өндірістік микроорганизм алу
үрдісінде оның генетикалық ақнаратын
озгертеді, жағымсыз қасиеттерді
болдырмай және қажетті қасиеттерін
күшейтіп немесе микроорганизмдерге
басқа бір жаңа қасиет беру
мақсатында мутацияға ұшыратады.
Мутацияның ең қарапайым түрі
нүктелік мутация, онда азоттық
негіздік бір жүбын басқа азоттық
негізге ауыстырады (мысалы, аденин-тиамин
гуанин-цитозинге). Басқа бір жағдайларда
негіздің бір жұбы жоғалып
кетуі мүмкін немесе керісінше,
негіздің басқа жүбы немесе
кішкентай ДНҚ бөлігі кіріп
кетуі мүмкін.
Мұндай өзгерулер
кез-келген ДНҚ молекуласында
репликация кезінде қателік салдарынан
мүмкін. Алайда спонтандық мутация
сирек болады. Мутацияны қажетті
бағытта ультрадыбыс, рентген
және радиосәуле немесе химиялық
мутагенез арқылы жүздеген есе
арттыруға болады, сол арқылы
ДНҚ негізін бағыттап немесе
нуклеин қышкылының репликациясына
әсер етуі мүмкін.
Индуцияланған
мутагенез зат алмасу үрдісінің
белгілі бір ауыт-кушылығына қажетті
метаболиттің жоғары өніміне
әкелуі ықтимал. Жоғары продуцентті
мутантты алудың әртүрлі механизмі
бар. Бұл ретроингибирлеуші механизмдерінің
томендеуі, кері байланыс бағытта
реттеу клетка ішінде ақырғы
өнімнің концентрациясы жоғарлауы
синтездейтін ферменттердің белсенділігін
тежейді.
Керісінше
клеткалық мембрана өткізгіштігін
жоғарылатып, ақырғы мақсатты
метаболиттің клеткадан жылдам
шығуын мутация көмегімен және
қоректік орта құрамындағы биотин концентрациясын
төмендету арқылы немесе пенициллинді,
Твин-40 және Твин-60 детергенттерін, могары
май қышқылы туындылары пальмитаттар
және стеараттарды қосу арқылы қамтамасыз
етуге болады; индуктор немесе операторды
тежейтін ақуыз-репрессордың қабілеттілігін
төмендету арқылы, тендер транскрипциясының
арттыруын қамтамасыз ететін промотор
белсенділігін жоғарлату, сотан сәйкес
мақсатты метаболит синтезін немесе индукция
синтезін және ферменттер белсенділігін
жотарлату арқылы қажетті метаболизм
жолдарды бір қалыпты ұстау; клетканың
тіршілік етуіне қатыспайтын метаболизм
жолымен түзілген қажетсіз өнімдерді
алып тастау арқылы; клеткадағы мақсатты
метаболит синтезделе-тін бастауыш затының
концентрациясын жоғарлату көмегімен
клетканың мембрана өткізгіштігін жоғарылатып,
ақырғы мақсатты метаболйттің клеткадан
тез шығуын қамтамасыз етуге болады.
Жоғары өнімдердің
мутациялық селекция типтік механизмін
ашу үшін келесідей мысал келтіруге
болады. Жануарлар клеткасы өздігімен
синтездей алмайтын алмастырылмайтын
аминқышқыл - лизин, оның жемдік
шөптерде де концентрациясы аз.
Сол себепті лизин аминқышқылын
өндірістік жағдайда Corynebacterium glutamicum
және Brevibacterium flavum атты мутантты штамдар
көмегімен алу жолға қойылған.
Бұл микроорганизмдердің тармақталған
биосинтез үрдісі жолының ақырғы
метаболиті лизин болып табылады,
бүл жол үш аминқышқыл синтезделеді
- лизин, метионин және треонин.
Бактериалық клетканың қажеттілігін
үзбей қамтамасыз ету үшін
аминқышқылдар биосинтез жолының
алғашқы ферменті аспартаткиназаның
белсенділігін соңғы өнім - треонин
мен лизин қосылып тежеулері
қажет. Клеткада треонин мен
лизин концентрациялары көп болатын
болса, синтезді тоқтату мақсатымен
аспартаткиназа ферментінің белсенділігі
тежеледі, ал егер де, керісінше,
осы аминқышқылдардың біреуінің
концентрациясы жеткіліксіз болса,
аминқышқылдарды синтездеу жылдамдығы
жоғарлайды.
Лизиннің жоғары
синтезін алу екі түрлі мутациялық
жолмен іске асты. Бірінші жағдайда,
гомосериндегидрогеназа ферментінің
генін мутацияға үшыратып, ферментативті
белсенділігін жоғалтты.
Нәтижесінде бактерия
метионин және аспартаткиназаның
бір тежеуші ингибиторын - треонин
синтезін тоқтатты. Мұндай мутант
қүрамында метионин мен треонин
аминқышқылдары бар қоректік
ортада ғана өсе алады.
Егер осы аминқышқылдар клеткалар
өсуіне жеткілікті болатын болса,
ал треонин лизинмен қосылып
аспартаткиназа белсенділігін тежеуге
жеткіліксіз болса онда мұндай
жағдайларда лизин бөгетсіз синтезделе
береді. Мутанттарды дақылдандыру үшін
өзіне қажетті өсу факторларын қажет етсе,
яғни қоректік орта қүрамына қосымша арнайы
заттарды (алынған мысалда метионин мен
треонин) талап етсе, ондай мутанттарды
ауксотрофтар деп атайды.
Мутацияның
басқа түрі аспартаткиназа ферментінің
өзінің өзгеруіне алып келді.
Аспартаткиназа ферменті - аллостериялық
фермент (alios - басқа), активті орталығынан
басқа төменгі молекулалы эффекторлармен,
оның ішінде лизин және треонинмен
байланысатын аллостериялық орталығы
бар. Аллостериялық орталықпен аминқышқылдар
байланысқаннан соң аспартаткиназа ферментінің
конформациясы өзгереді, нәтижесінде
активті орталыққа субстрат байланыса
алмай қалады және фермент белсендігін
жоғалтады. Мутация нәтижесінде фермент
лизинмен байланысын жоғалтып, ретроингибирлеу
механизмі жүзеге аспай қалады (10-сурет).
Escherichia coli бактериясында
треонин аминқышқылы биосинтезі
реттелуі екі механизммен жүреді
- ретроингибирлеу және репрессия.
Бактериялық клеткада алдымен
аспарагин қышқылы синтезделе
бастайды да, келесі кезеңде аспарагин
қышқылы негізінде треонин, метионин
және лизин (сол себепті үш
аминқышқыл да асщарагин қышқылы
түқымдасына жатады) синтезделеді.
Треонин концентрациясы клетка
қажеттілігінен асып кеткеннен
кейін, кері баиланыс (ретроингибирлеу)
арқылы өнім синтезін тежейтін
механизм белсенділігі артады, ал
треониннің артық мөлшері аспар-таткиназаны
инактивациялайды. Егер бүл реттеу
механизмі жеткі-ліксіз болатын
болса, треониннің артық мөлшерде
синтезделуі тоқтамай, әрі карай
треонин изолейцинге айнала береді.
Треонин мен изолейцин концентрацияларының
артық мөлшері бірігіп барлық
метаболизм жолдарының ферменттер
белсенділіктерін тежейді (репрессия)
Треониннің жоғары
продуценті Е. coli бактериясының мутантты
штамында - треониннің жоғары өнімділігінің
синтезін кері байланыс арқылы
реттейтін жолы бұзылған, яғни
треониннің аспартаткиназамен байланысы
бұзылған, сонымен қатар изолейцин
синтезіне қатысатын фермент
тежелген.
Ашытқы клеткаларын сүрыптағанда
вегетативті, ііарасексуалды гибридизация
қолданылып, будандасу ата−аналык
хромосомаларды біріктіріп, нәтижесінде
қажетті қасиетке ие гибрид алынады.
Мысалы, сахароза мен мальтозаны ашытқанда
қолданылатын Saccharomyces carlsbergensis өндірістік
штамды (сыра өндірісінде қолданылатын
штамм) бұл көмірсуларды ыдыратпайтын
Saccharomyces globusus жабайы штамымен будандастыру
жағдайда мальтозаны ғана ыдырататын
гибрид алынды. Бұл гибридтік штамм
"бархатты" сыра алу технологиясында
қолданылады.
1983 жылы С. Браунд пен
С. Оливер селекция әдісін қолданып,
үздіксіз режимде (650 сағат) дакылдандыруда
өнімнің жоғары концентрациясына
(40% этанол) төзімді болатын ашытқылардың
мутантты штамын сұрыптап алды.
Ұзақ дақылдандыру кезінде, бейімделу
механизмдер арқасында, спонтанды
мутациялар нәтижесінде 10% этанолға
төзімді және де көбейе алатын
штамм алынды.
Органикалық
қышқылдардың биотехнологиялық
өндірісінде бұл метаболиттерді
моноөнім түрінде өндіретін және
пайдаланылатын субстраттың көміртегі
көзін жоғары утилизациялайтын
микроорганизмдердің селекциялық
штамдары қолданылады. Осы мутанттар
өндірістік цикл технологияларына,
жағдайларына бейім-делген және
қосалқы өнімдерді айтарлықтай
синтездемейді. Оларды органикалық
қышқылдарды өндіруде қолданғанда
сүт қыщ-қылының өнімділігі - 90%, глюкон
қышқылының - 96%, сірке қыш-қылының
- 90-98%, лимон қышқылының - 85%, итакон
қышқы-лының - 60% болды.
Микроорганизмдердің
мақсатты өнімді бастапқы штамынан
көп есе артық синтездейтін
мутантты алған соң, зерттеушілер
алдында келесі өте маңызды
міндет түрады. Клеткада ферментативті
реакциялар нәтижесінде өсуге
қатаң түрде кажетті пропорцияларда
сан алуан заттардың әркайсысы
түзіледі. Рационалды, экономикалық
жағынан тиімді метаболизмге
кепіл болатын химиялық өзгерістерінің
координациясы метаболизм жолдардың
бірінің қарқынын езгерту, ферменттер
активтілігін реттеу арқылы жүзеге
асады.
Бағытты өзгертілген
генетикамен, бір метаболиттік
жолдың күшеюімен клеткалардың
тіршілігіне қажетті басқа жолдың
бүлінуімен болатын мутантты
микроорганизмнің конкуренттікке
кабілеттілігі төмендейді. Бір метаболиттің
артық мөлшері үтымды емес, клеткаға
кажетсіз. Сондыктан, реверсия немесе
кері мутация болуы мүмкін, егер
реттеуші тендер аталған штамның
бастапқы генетикалық профилін
қалпына келтірсе.
Рекомбинантты ДНҚ
технологиясы
Рекомбинантты
ДНҚ технологиясын (РДТ) in vitro жағдайьшда
әртүрлі ДНК молекулаларын, бөтен
гендерін біріктіру технологиясын
іске асырып, кейін реципиент
организмде олардың репликациясын
жүргізіп инженерия аясындағы
жетістік деп сипаттауға болады.
Рекомбинантты ДНҚ технологиясының
тірі клеткада, in vivo жағдайында мутация
және рекомбинация негізінде
жүретін дәстүрлі клеткалық селекциядан
айырмашылығы осында.
Екінші айтарлықтай
айырмашылығы: РДТ - бұл мүлдем
түрлі генетикалық материалдарды
қосу және клондау (мысалы, прокариот
және эукариот организмдер гендерін
біріктіру). Ал дәстүрлік селекцияда
бүл мүмкін емес. РДТ молекулалық
биология, нуклеин қышқылдарының
химиясы, гендік-инженерлік энзимология
жетістіктері арқылы түраралық,
тінаралық тосқауылдарды жеңуге
мүмкіндік береді.
Дәстүрлік селекция
алдымен жаңа штаммпродуценттерді,
осімдіктердің жаңа сортын, жануарлардың
жаңа түқымын алуда белгілі
нәтижелерге қол жеткізеді. Кейін
алынған онімнің фенотиптік өзгерістеріне
жауапты гендерді анықтауга зерттеулер
жүргізеді. Ал РДТ алдымен генетикалық
өзгерістердің багдарламасын жасайды,
содан кейін өнімді алып фенотиптік
қорытындысын жасайды.
Кейбір зерттеушілер
РДТ гендік микрохирургия деп
атайды, бірақ ол рестриктазалар
мен лигаза ферменттері арқылы
жүзеге асатын химиялық хирургия.
Сонымен қатар,
РДТ - бүл дәстүрлік селекцияның
жалғасы, мутантты организмдер
алу кезінде мутация мен рекомбинация-ларды
практика жүзінде қолдану нәтижелерініц
анализі. Спонтанды және индуцияланған
мутациялар, рекомбинацияның әр
түрлі әдістері (конъюгация, трансформация),
in vitro-дa ДНҚ рекомбинантты молекуласын
жасау - мұның бәрі зерттеу
нысаны ген болатын клеткалық
және молекулалық генетиканың
эволюциялық жетістіктері.
РДТ дәстүрлік
селекция жетістіктерінен бас
тартпайды, керісінше оған негізделеді.
Модификацияланған
организмдерді алу технологиясын
мазмұндаудан бұрын клеткадағы
генетикалық ақпараттьң сақталу
және берілу механизмдеріне тоқталған
жөн және прокариот пен эукариот
организмдер арасындағы айырмашылықтарды
атап өткен жөн.
Бактериалық клетка
геномы жалгыз хромосомасында (95-98%) және
плазмидасында (2-5%) орналасқан. Тіршілік
үшін маңызды генетикалық ақпараттың
басым бөлігі хромосомада жиналған суперспиралданған
ДНҚ молекуласы ретінде берілген. ДНҚ
екі спиральдан түрады, олардың әр қайсысы
белгілі нуклеотидтер (аденин, тимин, гуанин,
цитозин) тізбегінен түрады. Бұл негіздер
комплементарлы: бір тізбектің аденині
келесі тізбектегі тиминмен, ал гуанин
цитозинмен жұп құрайды. Негіздердің миллиондаған
жүптары ген құрылымын қалыптастырады
(бір құрылымдық генде мынга жуық негіздер
жұбы), соңғылары ақуыз синтезін кодтайды.
Құрылымдық гендерге жанасқан негіздер
тізбегі - бұл гендердің клеткада - матрицалық
РНҚ синтезінің және трансляцияның -мРНҚ-ны
рибосомалардағы матрица ретінде қолданумен
ақуыз түзілуі экспрессиясын бақылауды
жүзеге асырады.