ОГЛАВЛЕНИЕ 
 

 

Вопрос № 30

     Способы культивирования микроорганизмов. Поверхностное и глубинное, периодическое и непрерывное культивирование.

     Ответ:

     Существует  два способа культивирования  микроорганизмов – продуцентов  ферментов: поверхностный и глубинный.

     Первый  способ, применяемый для культивирования  микроскопических грибов, характеризуется  развитием мицелия на поверхности твердого или жидкого субстрата. На жидком субстрате образуется пленка мицелия, продуцирующего не только амилолитические ферменты, но и органические кислоты, инактивирующие их, поэтому используют твердые субстраты с развитой поверхностью – пшеничные отруби, дробину барды, картофельную мезгу и др.

     Максимальная  активность ферментов достигается  при культивировании грибов на пшеничных  отрубях. При поверхностном культивировании  пшеничные отруби должны быть увлажнены  и простерилизованы. В стерильных условиях готовят посевную культуру, но выращивают грибы в нестерильных условиях в кюветах, устанавливаемых в негерметичных камерах. Теплоту, выделяющуюся в процессе роста грибов, удаляют продуванием через растильную камеру стерильного кондиционированного воздуха.

     Поверхностный способ выращивания микроскопических грибов имеет ряд преимуществ. Так  как во время роста гриба отруби не перемешиваются, посторонние микроорганизмы не распространяются по всей их массе  и вызывают лишь незначительное местное инфицирование, которое, как правило, не влияет на активность ферментов. Однако все же необходимо стерилизовать воздух, среды и оборудование.

     Недостаток  поверхностного способа – необходимость  устанавливать множество кювет, работу с которыми трудно механизировать. Себестоимость культуры гриба-продуцента высока, причем в основном из-за затраты большого количества ручного труда. Механизация процесса выращивания возможна путем создания непрерывнодействующих установок, или бескюветных аппаратов с вертикальным толстым слоем питательной среды и интенсивным продуванием воздуха через этот слой.

     Глубинную культуру микроорганизмов выращивают на жидкой питательной среде при  энергичной аэрации в герметически закрытых аппаратах и в стерильных условиях. Процесс полностью механизирован. Стерильность глубинной культуры микроорганизма-продуцента ферментов положительно отражается на результатах сбраживания сусла дрожжами.

      Известны  следующие способы глубинного культивирования: периодический, непрерывно-циклический и непрерывно-проточный.

      Периодический способ характеризуется несменяемостью питательной среды в ферментере, состав которой в процессе развития постепенно изменяется. Процесс протекает по-стадийно: в ферментер набирают питательную среду и задают посевной материал; после размножения микроорганизмов и накопления продуктов их обмена зрелую культуру выгружают, а все оборудование, коммуникации и запорные устройства промывают, а затем стерилизуют паром.

      При непрерывноциклическом способе микроорганизмы, расположенные на неподвижной насадке в ферментере, омываются средой, протекающей в замкнутом контуре, до полного потребления ими питательных веществ. После этого зрелую культуру выгружают, начиная с последнего, аппараты промывают, стерилизуют и цикл повторяют с последнего головного ферментера. Богатая питательными веществами среда в ходе такой циклической ферментации постепенно истощается; по времени пребывания среды в зоне реакции этот процесс более продолжителен, чем периодический.

      Непрерывно-проточный способ культивирования микроорганизмов более совершенен. Суть его заключается в том, что микробная популяция развивается в проточной питательной среде. Способ имеет две разновидности: гомогенно-непрерывный и градиентно-непрерывный. В первом случае выращивание ведут в одном ферментере; при тщательном перемешивании среды и аэрации обеспечивается одинаковое состояние культуры во всем объеме жидкости. В ферментер при этом непрерывно поступает свежая среда, а из него также непрерывно вытекает избыток зрелой культуральной жидкости.

      Градиентно-непрерывное  культивирование осуществляют в  батарее ферментеров, соединенных  переточными трубами. Засеянная среда с большим содержанием углеводов и других ингредиентов непрерывно перетекает из одного ферментера в другой и также непрерывно вытекает в виде готовой культуры.

      Непрерывным культивированием в проточных средах можно выращивать микроорганизмы в  условиях, оптимальных для их стадии развития. При этом такие важные факторы, как концент-

     рация питательных веществ, количество продуктов обмена, рН, содержание растворенного кислорода, резко изменяющиеся при периодическом способе культивирования, поддерживаются постоянными на заданном уровне или изменяются по разработанной программе.

      Способы непрерывного культивирования в  производстве ферментных препаратов для спиртового производства еще находятся в стадии производственных испытаний. Поэтому, к сожалению, в настоящее время на заводах до сих пор применяют периодическое культивирование микроорганизмов.

Вопрос  № 37

     Взаимосвязь микроорганизмов с окружающей средой. Классификация факторов внешней среды (экологических факторов), влияющих на микроорганизмы. Что понимается под понятиями «Гибель микроорганизмов», «реактивация», «мутагенное», «бактерицидное» действие.

     Ответ:

     Все существующие микроорганизмы живут в непрерывном взаимодействии с внешней средой, в которой они находятся, поэтому подвергаются разнообразным влияниям. В одних случаях они могут способствовать лучшему развитию, в других подавлять их жизнедеятельность. Необходимо помнить, что изменчивость и быстрая смена поколений позволяет приспосабливаться к разным условиям жизни. Поэтому быстро закрепляются новые признаки.

     Находясь  в процессе развития в тесном взаимодействии со средой, микроорганизмы не только могут  изменяться под её воздействием, но могут изменять среду в соответствии с особенностями. Так микробы в процессе дыхания выделяют продукты обмена, которые в свою очередь изменяют химический состав среды, поэтому меняется реакция среды и содержание различных химических веществ.

     Все факторы, влияющие на развитие микробов, делят на:

• Физические
• Химические
• Биологические

     Ниже  подробнее рассмотрим каждый из факторов.

     1. Физические факторы 

     Температура

     По  отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на термофильные, психрофильные и мезофильные.

• Термофильные виды. Зона оптимального роста равна 50-60°С, верхняя зона задержки роста - 75°С. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена.
• Психрофильные виды (холодолюбивые) растут в диапазоне температур 0-10°С, максимальная зона задержки роста 20-30°С. К ним относит большинство сапрофитов, обитающих в почве, пресной и морской воде. Но есть некоторые виды, например, иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонад, вызывающие заболевания у человека.
• Мезофильные виды лучше растут в пределах 20-40°С; максимальная 43-45°С, минимальная 15-20°С. В окружающей среде могут переживать, но обычно не размножаются. К ним относится большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

     Высокая температура вызывает коагуляцию структурных  белков и ферментов микроорганизмов. Большинство вегетативных форм гибнет при температуре 60°С в течение 30 мин, а при 80-100°С – через 1 мин. Споры бактерий устойчивы к температуре 100°С, гибнут при 130°С и более длительной экспозиции (до 2 ч.).

     Для сохранения жизнеспособности относительно благоприятны низкие температуры (например, ниже 0°С), безвредные для большинства  микробов. Бактерии выживают при температуре  ниже –100°С; споры бактерий и вирусы годами сохраняются в жидком азоте (до –250°С).

     Влажность

     При относительной влажности окружающей среды ниже 30% жизнедеятельность  большинства бактерий прекращается. Время их отмирания при высушивании  различно (например, холерный вибрион  – за 2 суток, а микобактерии – за 90 суток). Поэтому высушивание не используют как метод элиминации микробов с субстратов. Особой устойчивостью обладают споры бактерий.

     Широко  распространено искусственное высушивание  микроорганизмов, или лиофилизация. Метод включает быстрое замораживание с последующим высушиванием под низким (вакуумом) давлением (сухая возгонка). Лиофильную сушку применяют для сохранения иммунобиологических препаратов (вакцин, сывороток), а также для консервирования и длительного сохранения культур микроорганизмов.

     Влияние концентрации растворов на рост микроорганизмов  опосредовано изменением активности воды как меры доступной для организма  воды. И если содержание солей вне  клетки окажется выше их концентрации в клетке, то вода будет выходить из клетки. Угнетение патогенных бактерий хлористым натрием обычно начинается при его концентрации около 3%.

     Излучения

     Солнечный свет губительно действует на микроорганизмы, исключением являются фототрофные виды. Наибольший микробицидный эффект оказывает коротковолновые УФ-лучи. Энергию излучения используют для дезинфекции, а также для стерилизации термолабильных материалов.

     УФ-лучи (в первую очередь коротковолновые, т.е. с длиной волны 250-270 нм) действуют на нуклеиновые кислоты. Микробицидное действие основано на разрыве водородных связей и образовании в молекуле ДНК димеров тимидина, приводящем к появлению нежизнеспособных мутантов. Применение УФ-излучения для стерилизации ограничено его низкой проницаемостью и высокой поглотительной активностью воды и стекла.

     Рентгеновское и g-излучение в больших дозах также вызывает гибель микробов. Облучение вызывает образование свободных радикалов, разрушающих нуклеиновые кислоты и белки с последующей гибелью микробных клеток. Применяют для стерилизации бактериологических препаратов, изделий из пластмасс.

     Микроволновое излучение применяют для быстрой повторной стерилизации длительно хранящихся сред. Стерилизующий эффект достигается быстрым подъемом температуры.

     Ультразвук

     Определенные  частоты ультразвука при искусственном  воздействии способны вызывать деполимеризацию органелл микробных клеток, под действием ультразвука газы, находящиеся в жидкой среде цитоплазмы, активируются и внутри клетки возникает высокое давление ( до 10 000 атм). Это приводит к разрыву клеточной оболочки и гибели клетки. Ультразвук используют для стерилизации пищевых продуктов (молока, фруктовых соков), питьевой воды.

     Давление

     Бактерии  относительно мало чувствительны к  изменению гидростатического давления. Повышение давления до некоторого предела  не сказывается на скорости роста обычных наземных бактерий, но в конце концов начинает препятствовать нормальному росту и делению. Некоторые виды бактерий выдерживают давление до 3 000 – 5 000 атм, а бактериальные споры - даже 20 000 атм.

     В условиях глубокого вакуума субстрат высыхает и жизнь невозможна.

     Фильтрование

     Для удаления микроорганизмов применяют  различные материалы (мелкопористое  стекло, целлюлоза, коалин); они обеспечивают эффективную элиминацию микроорганизмов  из жидкостей и газов. Фильтрацию применяют для стерилизации жидкостей, чувствительных к температурным воздействиям, разделения микробов и их метаболитов (экзотоксинов, ферментов), а также для выделения вирусов. 

 

      2. Химические факторы 

     Способность ряда химических веществ подавлять  жизнедеятельность микроорганизмов зависит от концентрации химических веществ и времени контакта с микробом. Дезинфектанты и антисептики дают неспецифический микробицидный эффект. Бактерицидным действием обладают химические вещества различных групп: кислоты, щелочи, спирты, поверхностно-активные вещества, фенолы и их производные, соли тяжелых металлов, окислители, группа формальдегида, газообразные вещества и др. Большое разнообразие природы и химической структуры указанных веществ обусловливает и различные механизмы их бактерицидного действия на микробную клетку.