Микробиологические методы исследования микроорганизмов

Метод исследования в свете  люминесценции

 Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.  

                                               Ультрафиолетовая микроскопия

Основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400—250 нм). Этим свойством обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин, триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов — их изменения в процессе жизнедеятельности.   

 Инфракрасная  микроскопия позволяет исследовать  непрозрачные для видимого света  и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750—1200 нм. Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот вид М.м.и. наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.    

                                          Стереоскопическая микроскопия

{1.2 c 257.} Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии, в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.    

 Для изучения  на субклеточном и макромолекулярном  уровнях структуры клеток, тканей  микроорганизмов и вирусов используют  электронную микроскопию. Этот  М.м.и. позволил перейти на качественно  новый уровень изучения материи.  Он нашел широкое применение  в морфологии, микробиологии, вирусологии,  биохимии, онкологии, генетике, иммунологии,  Резкое повышение разрешающей  способности электронного микроскопа  обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться от них (сканирующая электронная микроскопия),

отклоняясь под  разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур при сканирующей — объемное. Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования, позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования.  

{1.6 ст 15}  Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности химической или физической фиксации тканей и микроорганизмов. Биопсийный материал и секционный материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30—50 нм. Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так называемые реплики, повторяющие контуры образца. 

Методика  микроскопии в  Проходящем Поле

(метод  светлого Поля)

{1.1 ст 17}  Метод светлого поля является основным методом исследования объекта в проходящем свете. Для осуществления этого метода необходим микроскоп проходящего света, объективы светлого поля (×4, ×10, ×20, ×40), конденсор, осветитель. Световой поток от источника света направляется в конденсор, затем пучок света равномерно направляется на плоскость препарата. Конденсор создает световой конус, обеспечивающий заполнение светом входного отверстия (апертуру) объектива. Порядок работы:

1. Установить  препарат на предметный столик  и зафиксировать его положение.

2. Поворотом  револьверной головки установить  объектив (×4 или ×10).

3. С  помощью макро- и микровинтов  получить четкое изображение  объекта.

4. Раскрыть  апертурную диафрагму конденсора.

5. Поднять  конденсор до положения наибольшей  яркости освещения в плоскости  объекта.

6. Яркость  освещения объекта регулировать  только диафрагмой конденсора.

Возможные проблемы микроскопии и их решение 

Смена объективов при проведении микроскопии.

Методы  микроскопического исследования имеют целью идентификацию микроорганизмов и подсчет клеток. Эти задачи достигаются просмотром препарата при различных увеличениях с использованием объктивов разной мощности. Смена объектива начинается от

маломощного увеличения к высокому, сужая видимую часть поверхности мазка. Это ознчает, что можно видеть сотни клеток в полезрения, но ни одного микроорганизма при увеличении ×4, и только несколько клеток, но сотни микроорганизмов при увеличении ×100.

Таким образом, очевидно, что каждое следующее  увеличение дает возможность определять некоторые мелкие детали и в то же самое время «прячет контекст» или окружающие детали. Чтобы не потерять информацию, поступающую при каждом увеличении, исследователь

должен  удерживать в памяти  все увеличения и воссоздавать в воображении весь мазок в мельчайших подробностях. Для этого можно попытаться представить себе процесс проведения микроскопической оценки, поделенный на несколько уровней. Каждый уровень —

это разное увеличение. На каждом уровне могут быть сделаны некоторые  заключения (о микроскопических объектах, которые мы можем четко видеть) и некоторые предположения (о микроскопических объектах, которые мы не можем видеть отчетливо). Каждый следующий уровень (или увеличение) подтвердит или опровергнет предположение, возникшее от предыдущего увеличения, поскольку большее увеличение дает четкое изображение предыдущего мелкогообъекта, позволяя предположению стать заключением.

Порядок проведения микроскопического исследования:

• Порядок  исследования мазков должен быть выбран самим исследователем. Можно начать с нативного влажного мазка, дожидаясь подсыхания мазка, окрашенного метиленовым синим или по Граму. И наоборот, можно начать с окрашенного препарата, дожидаясь, пока движение жидкости под покровным стеклом не прекратится. Делая этот выбор, следует учитывать два момента: выбранный порядок исследования мазков должен экономить время и быть наибо-

лее удобным для получения информации о пациенте.

• Исследование влажного мазка. Поместите стекло на предметный столик мазком вверх. Следует выбирать диафрагму, позволяющую полностью провести микроскопию влажного мазка. Если Ваш микроскоп не оснащен диафрагмой, подобного эффекта можно достичь, опуская конденсор. Не забывайте открывать диафрагму после завершения микроскопии влажного мазка.

• Выбор  объектива. Микроскопия должна начинаться с наименьшего увеличения. Общая ошибка начинающих — приступать к микроскопии не при малом увеличении или пользоваться малым и средним в течение очень короткого времени. На самом деле, обычно наибольшая часть всей информации поступает при самом малом увеличении. С накоплением опыта становится ясно, что большое увеличение нужно только для подтверждения того, что уже очевидно при малом увеличении. Обычно влажный мазок из влагалища покрывает большую поверхность стекла по сравнению с уретральным или цервикальным мазками, так что удобно начинать микроскопию нативных препаратов, применяя сканирующее увеличение (объектив ×4). Если Ваш микроскоп не оборудован такой револьверной оправой, тогда применяйте объ-

ектив ×10. Уретральные и цервикальные мазки обычно занимают меньшую часть поверхности стекла, так что их можно просматривать с применением объектива ×10.

• Под  визуальным контролем сбоку устанавливается  наименьшее расстояние между предметным стеклом и объективом при помощи макрометрического винта. Затем через окуляр набдается появление изображения при поворачивании этого винта в обратном направлении. При помощи микрометрического винта настраивается максимально четкое изображение.

• Настройка  силы света. При проведении микроскопии влажного мазка можно повысить резкость изображения, настраивая силу света. Если имеется возможность менять силу света на вашем микроскопе, это может быть достигнуто изменением апертуры диафрагмы. Также удобно изменять силу света при смене объектива во время микроскопии мазков, окрашенных метиленовым синим. Маломощный объектив имеет большую апертуру, так что достаточно подавать меньше света и, наоборот, для получения четкого изображения высокомощная револьверная оправа требует больше света.

• Сканирование всего влажного мазка проводится с помощью объектива ×4. Полезно просмотреть клинический материал, обнаруживая места равномерного распределения клеток и в то же время, отмечая места, где встречаются скопления или некоторые изменения плотности. Если клинический материал распределился равномерно и никаких скоплений не найдено, можно изменить увеличение, рассматривая каждый участок мазка. Если отмечается изменение

плотности или появление скоплений, следует попытаться подвинуть край скопления к центру поля зрения и затем изменить увеличение. Это позволит исследователю этот участок увидеть болеечетко. Следует помнить, что более высокое увеличение «минимизирует» область поля зрения предыдущего увеличения и дает увеличенный вид центральной части. Если определенная область мазка, которую вы хотели бы увеличить, не появляется в поле зрения при большом увеличении, вернитесь к малому увеличению и попытайтесь подвинуть исследуемый участок препарата в самый центр поля зрения, а затем поменяйте объектив.

• Нужно  изучать, по меньшей мере, 10 полей  зрения, применяя объектив ×10. Это увеличение позволяет идентифицировать эпителиальные клетки и полиморфноядерные лейкоциты.

• Весь клинический материал из одной и той же анатомической области должен рассматриваться вначале при малом увеличении.

• При  замене обычно нет необходимости  пользоваться макрорическим винтом.

• Помните, что вы должны применять иммерсионное масло, используя только объективы ×90 или ×100. Если будет нужно перейти от масляной иммерсии к более низкому увеличению, необходимо опустить предметный столик для предохранения других объективов от замасливания.