Микробиологические методы исследования микроорганизмов

 

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный технический университет»

Кафедра «Промышленная экология и безопасность жизнедеятельности» 
 
 
 

СЕМЕСТРОВАЯ РАБОТА

по дисциплине « Микробиология»

на тему:

«Микробиологические методы исследования микроорганизмов» 
 
 
 

Выполнил:

Студент группы ПП-352

  Новик А. А.

      Проверил:

      профессор каф. ПЭБЖ

Самыгин В.М.                                                                                               
 
 
 
 

Волгоград,2011

Содержание:

- Введение

-Приготовление  мазков

- Световая микроскопия  

           Метод светлого поля и его  разновидности

           Метод темного поля и его  разновидности

           Метод фазового контраста

           Поляризационная микроскопия

       

           Ультрафиолетовая микроскопия

      

           Стереоскопическая микроскопия 

-Методика микроскопии в Проходящем Поле

-Вывод. 
 
 

          
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

   Введение:

Микроскопические методы исследования  способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет световая и электронная микроскопия. В практической и научной деятельности врачи различных специальностей  вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов. {1.7 ст 225}  Микроскопические метод исследования  включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Для проведения микроскопии сначала следует  сделать мазки.

Приготовление мазков: {1.2 ст 207}

 Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла. Материал  нанесенный на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу.

После этого  свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Таким образом, получаются мазки с равномерно распределенным материалом.

Высушивание и  фиксирование мазков 
Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры  на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

- Физический способ  фиксации 
Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2с. Надежность фиксации проверяют следующим приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

- Химический способ  фиксации 
Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения - этиловый (винный) спирт 960, ацетон, смесь Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (спирта 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, ледяной уксусной кислоты 10 мл).

Предпочтительнее  считается щадящая химическая фиксация (ацетон, смесь Никифорова, жидкость Карнуа)

Предметное стекло с высушенным мазком погружают в  склянку с фиксирующим веществом  на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Далее проводится классическая окраска мазка по методу Грама. Для проведения этой окраски могут быть использованы специальные комерческие красители, например, фирмы BioMerioux или красители, приготовленные непосредственно в лаборатории.

Окраска по Граму

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски. При сложных способах окраски на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой – дополнительным. Кроме красящих веществ, при сложных способах окраски применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и т.д.

Особенностью  окраски по Граму является неодинаковое отношение различных микроорганизмов к красителям трифенилметановой группы: генциановому, метиловому или кристаллическому фиолетовому. Микроорганизмы, входящие в группу грамположительных (Грам+), например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам(+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Грам-) микроорганизмы (бактероиды, фузобактерии и др.) образуют с генциановым кристаллическим или метиленовым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет. 
 

                                          Приготовление растворов

Кристаллический фиолетовый (фуксин Циля карболовый) – карболовый раствор: 1г кристаллического метилового фиолетового растирают в фарфоровой ступке с 5г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 мл спирта. После того как краситель хорошо разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор красителя фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой.

Раствор Люголя – 2г йодида калия растворяют в 5-10 мл дистиллированной воды, затем прибавляют 1г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного его растворения и после этого приливают приливают 295-290 мл дистиллированной воды.

Фуксин спирто-водный (раствор Пфейфера) – к 1 части карболового фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень не стойкий, поэтому его готовят в небольших количествах непосредственно перед употреблением. 
 

Методика  окраски

1. Фиксированный мазок окрашивают через фильтровальную бумагу основным красителем – раствором основного карболового кристаллического фиолетового. Прокрашивание длится 1-2 минуты.
2. Снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.
3. Раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стаканчик со спитртом, процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.
4. Препарат тщательно промывают водопроводной водой.
5. Докрашивают спирто-водным раствором фуксина.

 

 

Прокрашивание длится 1-2 минуты.

Результаты  окраски

  {1.5 ст 17} Грам(+) микроорганизмы окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, Грам(-), воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.

К недостаткам  этого метода окраски следует  отнести определенные трудности  при отнесении выявленных микроорганизмов  к Грам(+) или Грам(-) по цвету из-за их неоднородного прокрашивания ввиду возможности присутствия в вагинальном мазке большого количества слизи и разнообразных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. В этой связи Мавзютов А. Р. и соавт. предложили использовать для микроскопической диагностики БВ окраску метиленовым синим.

Окраска метиленовым синим 
Приготовление растворов:

• Раствор "А": 2,5 г кристаллического фиолетового растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 3-4 недели);
• Раствор "Б": 12,5 г натрия карбоната растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 2 нед., до выпадения кристаллов);
• Раствор йода: 1 г натрия гидроксида растворить в 7 мл дистиллированной воды, затем добавить 5 г кристаллического йода и 0,25 к калия йодида, к полученному раствору добавить дробно 243 мл дистиллированной воды;
• Смывная жидкость для обесцвечивания: 75 мл ацетона добавить к 175 мл этилового спирта;
• Раствор сафранина: 5 г сафранина растворить в 15-20 мл этилового спирта и добавить до 250 мл дистиллированной воды.

 

 

Окраска мазков

1. Мазки фиксируют над пламенем горелки. На свободную от исследуемнго материала часть стекла одновременно наносят по 6 капель растворов "А" и "Б". Смешивают стеклянной палочкой и равномерно распределяют по стеклу. Экспозиция – 2 мин.
2. Удаляют остатки краски и наносят раствор йода на 2 мин.
3. Удаляют остатки йода и наносят 10-20 капель смывной жидкости, повторяют манипуляцию до полного обесцвечивания, постоянно покачивая стекло.
4. Промывают водопроводной водой.
5. Докрашивают сафранином 2 мин.
6. Промывают водой, просушивают, микроскопируют.

 

        Существует несколько разновидностей микроскопии: Вот некоторые из них.

                                          Световая микроскопия   {1.4}