Лимоннокислое брожение

Лимоннокислое брожение

Лимоннокислое брожение,окисление плесневыми грибами из родов Aspergillus и Penicillum углеводов, некоторых спиртов и органических кислот до лимонной кислоты. Помимо лимонной кислоты, при Л. б. образуются небольшие количества глюконовой и щавелевой кислот. Вначале из углеводов гриб образует пировиноградную кислоту, которая затем превращается в щавелевоуксусную кислоту; последняя при участии фермента цитрат-синтазы конденсируется с ацетатом при участии кофермента А с образованием лимонной кислоты. Промышленное получение лимонной кислоты основано на сбраживании Aspergillus niger раствора сахарозы или мелассы. В пересчёте на потреблённый сахар образуется 70—75% лимонной кислоты.

 
 
Плесени в процессе дыхания также  окисляют углеводы нередко не до СО2 и Н2О, поэтому в среде накапливаются  продукты неполного окисления —  различные органические кислоты (щавелевая, янтарная, яблочная, лимонная и др.). Образование грибами лимонной кислоты применяют в промышленности. 
 
Лимоннокислым брожением называется окисление глюкозы грибами в лимонную кислоту. Конечный результат брожения можно представить следующим суммарным уравнением: 
 
2С6Н1206 +302 -> 2С6Н807 + 4Н20. 
 
Химизм образования лимонной кислоты из сахара до настоящего времени окончательно не установлен. Большинство исследователей считает, что это брожение до образования пировино-градной кислоты протекает, как и другие брожения. Далее превращение пировиноградной кислоты в лимонную через ряд кислот (уксусную, янтарную, фумаровую, яблочную, щевелево-уксусную) сходно с превращениями в цикле Кребса. 
 
Раньше лимонная кислота добывалась из цитрусовых плодов — лимонов и апельсинов. Этот способ очень невыгоден, так как плоды содержат только 7—9% лимонной кислоты. 
 
В настоящее время ее получают главным образом путем брожения 1. Технические приемы биохимического получения лимонной кислоты в СССР были разработаны В. С. Буткевичем и С. П. Костычевым. 
 
Возбудителем брожения является гриб Aspergillus niger. 
 
Основным сырьем служит меласса — черная патока. Раствор ее, содержащий около 15% сахара, в который добавляют необходимые для гриба питательные ^вещества (в виде различных минеральных солей), наливают 'невысоким (8—12см) слоем в плоские открытые сосуды (кюветы) и засевают спорами гриба. Кюветы помещают в бродильные камеры, которые хорошо аэри- 
 
1 Лимонную кислоту для технических целей получают путем переработки отходов табака и махорки. 
 
руются. Процесс продолжается 6—8 дней при температуре около 30° С. Гриб развивается на поверхности сбраживаемой жидкости. Выход лимонной кислоты достигает 60—70% израсходованного сахара. По окончании брожения раствор из-под пленки гриба сливают. Лимонную кислоту выделяют из раствора и подвергают очистке и кристаллизации. При отсутствии в растворе сахара эта кислота может быть окислена грибом до более простых продуктов — щавелевой и уксусной кислот, углекислого газа и воды. 
 
Описанный «поверхностный метод» (гриб развивается на поверхности сбраживаемого субстрата) получения лимонной кислоты заменяется в настоящее время «глубинным методом», при котором мицелий гриба растет в закрытых чанах (ферментаторах) в толще высокого слоя сбраживаемой жидкости, непрерывно перемешиваемой и аэрируемой стерильным воздухом. Этот способ повышает производительность труда, позволяет избежать заражения сбраживаемого субстрата посторонними микроорганизмами, его легче автоматизировать и механизировать. 
 
Лимонная кислота используется в кондитерской промышленности, производстве безалкогольных напитков, сиропов, кулинарии и медицине. 
 
 
 
 
 

При лимоннокислом  «брожении» образование лимонной кислоты  из сахара тесно связано с процессом  дыхания. В настоящее время показано, что накопление лимонной кислоты  плесневыми грибами — лишь одно из звеньев сложной цепи окислительных  превращений ди- и трикарбоновых кислот, называемых лимоннокислым циклом (см. Окисление биологическое). 
Образование лимонной кислоты происходит лишь до тех пор, пока запас субстрата не исчерпан. При полном использовании сахара накопившаяся лимонная кислота подвергается более глубокому окислению. Значительное накопление лимонной кислоты в культурах плесневых грибов дает возможность использовать их в технике для получения лимонной кислоты из сахара. Практическое применение находят и другие виды брожения. 
 

При аэробном брожение образующийся из пировиноградной  кислоты ацетил-КоА конденсируется со щавелевоуксусной кислотой с образованием лимонной, которая претерпевает дальнейшие превращения в цикле трикарбоновых кислот. Суммарное уравнение этого процесса:

Продуктами  аэробного брожение могут быть метаболиты цикла трикарбоновых кислот: лимонная, янтарная, фумаровая и другие. В норме они не накапливаются, однако имеются штаммы, главным образом микромицетов, способные накапливать эти соединения в больших количествах. Например, при лимоннокислом брожение выход продукта может достигать 70%, что обусловлено повышенной активностью в микроорганизме цитратсинтетазы. Интенсивное накопление фумаровой кислоты происходит при функционировании цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного цикла.

Брожение, ферментативное расщепление органических веществ, преимущественно углеводов. Может осуществляться в организме животных, растений и многих микроорганизмов без участия или с участием О₂ (соответственно анаэробное или аэробное брожение).

В результате окислительно-восстановительных реакций  при брожении освобождается энергия (главным образом в виде АТФ) и  образуются соединения, необходимые  для жизнедеятельности организма. Некоторые бактерии, микроскопические грибы и простейшие растут, используя  только ту энергию, которая освобождается при брожении. Общий промежуточный продукт у многих видов брожения - пировиноградная кислота СН₃С(О)СООН, образование которой из углеводов в большинстве случаев протекает таким же путем, как в гликолизе. Некоторые виды брожения, происходящие анаэробно под действием микроорганизмов, имеют важное практическое значение

Лимоннокислое брожение. В результате лимоннокислого брожения получается лимонная кислота  из углеводов, которые окисляются. Лимонная кислота не является конечным продуктом  окисления сахара, а может далее  использоваться как источник углерода.

Возбудителями лимоннокислого брожения являются некоторые  плесневые грибы, лучшим из которых  считается Aspergillus niger Ci'tromyces. На основании работ В. С. Буткевича и С. П. Костычева этот плесневой гриб используется для технического получения лимонной кислоты. По исследованиям

C. Р. Зубковой (1933—1936) биохимическим методом можно  получить лимонную кислоту и  из древесного сахара. Но для  этой 

цели лучшими  являются гидролизаты, полученные гидролизом

древесины концентрированной  кислотой, так как они свободны

от многих примесей и имеют высокую концентрацию сахара. 
 

Дозы  применения лимонной кислоты в пищевой  промышленности

Дозы  применения лимонной кислоты в пищевой  промышленности

Технология производства лимонной кислоты из мелассы методом  поверхностного культивирования.  В  отдельном цехе выращивают посевной материал — споры Aspergillus niger. Затем размножают его в трех стадиях — пробирках, колбах и алюминиевых кюветах. Длительность каждой стадии 2—4 сут, выращивание идет при 32°С. В пробирках используют твердую агаризованную сусло-среду, а в колбах и кюветах — жидкую среду. Во время культивирования на поверхноповторный ' сушилка. сти раствора образуется плотная пленка мицелия, которая затем покрывается конидиями. На последней стадии, т. е. из кювет зрелые и подсушенные конидии собирают при помощи специального вакуумного насоса. Цех конидий Экспериментального завода биохимических препаратов Института микробиологии им. Августа Кирхенштейна АН ЛатвССР обеспечивает посевным материалом не только свой цех лимонной кислоты, но и другие заводы, производящие лимонную кислоту.

Для удлинения  хранения конидии дополнительно  высушивают, смешивая с адсорбентом  — активным углем. В таком виде конидии можно хранить 1—2 года. С 10 дм2 площади кювет можно получить 3—4 г сухих конидий (площадь каждой кюветы 8,5 дм2).

Среду для лимоннокислого брожения готовят в специальном  отделении. Мелассу разбавляют до 30%-ного содержания сахара, подкисляют серной кислотой до рН 7,2—7,5, обрабатывают желтой кровяной солью для удаления железа, которое неблагоприятно влияет на лимоннокислое брожение.

Полученный раствор  кипятят и выдерживают 1—1,5 ч. Таким  образом освобождаются от вредной  микрофлоры. Перед переводом в  бродильню мелассный раствор разбавляют до оптимальной концентрации сахара (15%). К среде всегда добавляют источники фосфора, обычно в виде солей фосфорной кислоты, и другие минеральные вещества, например сульфат цинка, стимулирующий образование мицелия и биосинтез лимонной кислоты. Для активного синтеза лимонной кислоты в питательной среде кроме сахара должны содержаться 0,07% азота, 0,016—0,021% Р205, калий, магний, цинк и другие элементы в небольших количествах. Доказано, что количество азота, калия, магния, серы и железа в растворе мелассы достаточно велико, поэтому дополнительное введение их в среду излишне.

Лимоннокислое брожение идет в камерах. На полках камеры располагаются плоские кислотоустойчивые  металлические кюветы высотой 7—20 см. Каждая из них снабжена подачей и  отводом питательной среды. В  камере предусмотрена система вентиляции для подачи стерильного кондиционированного  воздуха, который равномерно распределяется по всей камере.

Стерильную кювету наполняют стерильной средой на высоту 4—7 см. Затем среду засевают конидиями (часто с помощью воздуха) и  дают возможность развиться мицелию. В первые 24— 36 ч, когда происходит интенсивный рост мицелия, температуру  поддерживают в пределах 34—36°С. Для  аэрации на каждый квадратный метр мицелия подают 3—4 м3/ч воздуха. Позже  подачу воздуха увеличивают (12—15 м3/ч), а температуру снижают до 32—34°С. Максимальный рост мицелия достигается  на 4-е сутки, а кислота интенсивнее  всего синтезируется на 5-е сутки, когда каждый квадратный метр мицелия продуцирует в среднем 100— 105 г/ч лимонной кислоты. Работая по безобменному методу, цикл брожения заканчивают через 8—9 сут. Активные продуценты лимонной кислоты, например штамм Aspergillus niger ЭУ-119, обеспечивают в производственных условиях получение до 1400 г/м2 в сутки лимонной кислоты. Выход кислоты составляет 687о от количества сахара.

Длительность  цикла брожения можно увеличить, обеспечив мицелий свежей питательной  средой. В этом случае после удаления из кюветы основного раствора и промывания мицелия стерильной водой под  его пленку заливают свежую питательную  среду (толщина слоя 6 см)—метод доливок—и  продолжают сбраживание. В основе метода лежит введение питательного раствора род пленку мицелия через 6—7 сут культивирования, когда концентрация сахара уменьшается до 3—4%. Таким образом, в ходе одного цикла удается переработать на 30—35% больше питательной среды и удлинить цикл до 12 сут.

В конце процесса брожения жидкость культивации сливают  и мицелий промывают. Промывные  воды используют далее, а мицелий  после высушивания используют для  нужд животноводства или для получения  ферментного препарата пектиназы.

В 1 л жидкости культивации содержится 40—50 г лимонной кислоты, 3 г глюконовой кислоты, 1 г щавелевой кислоты и 7 г не-сброженного сахара. Таким образом, из общего количества кислот лимонная составляет 90%.

Лимонную кислоту  из раствора выделяют химическим путем. В специальных нейтрализаторах  раствор нейтрализуют, добавляя химически  чистый мел — в осадок выпадают цитрат кальция и оксалат (глюконат остается в растворе). Горячий раствор фильтруют и затем из цитрата кальция в реакторе с H2SO< получают раствор лимонной кислоты

Са3 (С6Н50,)2 + 3H2S04 2CeH80, + 3CaS04.

При добавлении строго определенного количества серной кислоты освобождается только лимонная кислота, а оксалат остается в  растворе. Затем раствор обесцвечивают  активированным углем, и с помощью  желтой кровяной соли осаждают железо. Горячую массу фильтруют в  нутч-фильтрах. Осадки на фильтре промывают горячей водой и присоединяют ее к раствору лимонной кислоты.