Гибридизация нуклеиновых кислот

Радиоактивно  меченные участки выявляют путем  экспонирования фильтра с рентгеновской  пленкой (ауторадиография). После проявления на пленке видны полосы меченной зондом ДНК.

Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью  флюоресценции или опосредованно  с помощью антител.

Итак: Саузерн-блот гибридизация - метод анализа структуры  заданной области генома, основанный на:

- 1) расщеплении  геномной ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции ;

- 2) разделении  множества полученных фрагментов  с помощью электрофореза в плоской пластине агарозного или другого геля;

- 3) перенесении  продуктов разделения на лист  пористого материала, например, на  нитроцеллюлозный фильтр таким  образом, что все фрагменты  ДНК переносятся на фильтр  и закрепляются на нем, создавая  отпечаток, идентичный распределению  фрагментов в геле после разделения;

- 4) гибридизации  фильтра с меченым радиоактивно  или с помощью красителя фрагментом  ДНК или РНК (пробой), который  по последовательности соответствует  анализируемому участку генома. В результате, проба за счет  комплементарных взаимодействий  связывается с теми участками  фильтра, где находятся исследуемые  фрагменты генома, и положение  этих фрагментов идентифицируется  по положению метки из пробы  на фильтре.

И как было сказано выше, с помощью Саузерн-блот гибридизации удается определять идентичность или различие длин фрагментов ( полиморфизм длин рестриктных фрагментов, ПДРФ ), получаемых при рестриктном расщеплении одного и того же локуса в разных сравниваемых геномах. 
 

Дот-блот-гибридизация

На втором этапе  аллель-специфичной гибридизации ДНК  иммобилизуют на фильтре и гибридизуют  с олигонуклеотидным зондом, охватывающим участок с предполагаемой мутацией. Обычно используют зонды с радиоактивно меченными концами. 
А. Иммобилизация ДНК на нитроцеллюлозном фильтре  
 
Материалы  
 
• Образцы ДНК 
• 1 М NaOH

• Буфер ТЭ 
• 2 М ацетат аммония 
• Нитроцеллюлозные фильтры (ВА85, Schleicher & Schuell) 
• Прибор для дот-блот-гибридизации (например, Manifold-II, Schleicher & Schuell; Bio-Dot SF, Bio-Rad) 
Методика 1.10 мкг ДНК растворяют в 50 мкл 0,4 М NaOH, приготовленной на ТЭ-буфе ре. 
2. Инкубируют раствор при 37 С 10 мин и нейтрализуют его равным объемом 2 М ацетата аммония. 
3. Вручную или с помощью прибора для дот-блот-гибридизации наносят ДНК на нитроцеллюлозный фильтр. 
4. Прожаривают фильтр при 80 °С под вакуумом в течение 2 ч. 
Б. Гибридизация  
 
Материалы  
 
• 20 х SSPE: 3 М NaCl, 200 мМ NaH2P04, 50 мМ ЭДТА, рН 7,4 
• 100 х раствор Денхардта: 2% (в/о) фиколл, 2% (в/о) поливинилпирролидон, 2% (в/о) БСА (фракция 5). Раствор готовят на стерильной дистиллированной воде 
• 10 х SSC 
• Буфер для отмывания: 3 М тетраметиламмонийхлорид, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, мМ ЭДТА, 0,1% ДСН 
• 10% ДСН 
• 32Р-зонд 

Методика 1 . Проводят предгибридизацию при 65 С в течение 2 ч в буфере следующего состава: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, 5% ДСН. 2. Добавляют 32Р-зонд (1 — 1,5 мкМ). 
3. Проводят гибридизацию при 65 "С в течение 6 ч (или в течение ночи). 
4. При непрерывном покачивании отмывают фильтр в следующих растворах: 
 
а) 5 х SSC: две смены по 15 мин при комнатной температуре; 
 
б) буфер для отмывания: 20 мин при 61 С; 
 
в) 5 х SSC: 10 мин при комнатной температуре. 
5. Высушивают фильтр на воздухе и проводят радиоавтографию. 
 
Эффективность гибридизации и стабильность гибридов зависят как от искомой последовательности, так и от размера зонда (олигонуклеотида); оптимальные условия отмывания для каждого зонда подбирают опытным путем. В каждом эксперименте в число образцов включают мутантную и немутантную ДНК и Проводят гибридизацию с зондами, комплементарными как последовательности дикого типа, так и последовательности, несущей мутацию. 
 
 
 
 

  Источники

 http://medicalplanet.su/genetica/370.html http://medbiol.ru/medbiol/slov_sverd/00030d2a.htm http://meddialab.ru/medicinskaa_.htm http://medicalplanet.su/genetica/351.html http://humbio.ru/humbio/molevol/000a7cad.htm http://medbiol.ru/medbiol/har/0019438a.htm 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список

Гибридизация нуклеиновых  кислот………………………  1

ДНК-ДНК  гибридизация………………………………….. 2

Методика  блот-гибридизации РНК……………………....  3

Система   Sky View……………………………………....... 5

Система Spectral FISH…………………………………….... 7

Система FISH View……………………………………….... 8

Система BAND View……………………………………..... 8

Саузерн-блот гибридизация……………………………...... 9

Дот-блот-гибридизация……………………………….......12

Источники.......................................................................14

Список..............................................................................15