Гибридизация нуклеиновых кислот

 Гибридизация нуклеиновых кислот

Многие этапы  анализа рекомбинантной ДНК основаны на комплементарности взаимодействия цепей нуклеиновых кислот - необходимом  условии синтеза ДНК и РНК. Путем нагревания или обработки  щелочью двухцепочечную ДНК разделяют  на отдельные цепи (денатурированная ДНК). Денатурированную ДНК инкубируют в условиях, обеспечивающих гибридизацию нуклеиновых кислот, то есть повторное  образование двухцепочечных молекул  путем спаривания нуклеотидов комплементарных  цепей. Эта реакция настолько  специфична, что гибрид одноцепочечной молекулы ДНК с комплементарной  цепью (РНК или ДНК) можно выявить, даже если кДНК составляет лишь одну десятитысячную часть от общего количества ДНК.

Метод позволяет  различить полностью и частично гомологичные последовательности.

Специфичность гибридизации нуклеиновых кислот, часто  в сочетании с фракционированием  или амплификацией, позволяет выявить  нужный ген среди десятков тысяч  других или нуклеиновую кислоту  возбудителя инфекции даже тогда, когда  единственная ее копия приходится на несколько клеток человека.

Для выявления  гибридизационных зондов используют радиоактивную  метку или нерадиоактивные методы.

Часто применяется  гибридизация нуклеиновых кислот с  аллель-специфическими зондами. Такой  зонд представляет собой синтетический  одноцепочечный олигонуклеотид, обычно длиной 15-20 нуклеотидов. Синтезируют  два зонда, различающиеся одним  нуклеотидом. Один из них точно соответствует  нормальной последовательности, а другой - мутантной; в последнем замещенный нуклеотид расположен в средней  части зонда. Условия гибридизации подбирают таким образом, что  олигонуклеотид связывается только с идеально комплементарной ему  последовательностью. Аллель-специфические  олигонуклеотидные зонды можно использовать в сочетании с блоттингом по Саузерну , но сейчас их чаще используют в сочетании с амплификацией ДНК.

ДНК-ДНК  гибридизация

Метод ДНК-ДНК  гибридизации основан на том факте, что стабильность ДНК-ДНК дуплексов  при определенной температуре зависит  от числа нуклеотидов образующих комплементарные пары. Очевидно, что  число комплементарных нуклеотидов  в дуплексе где обе нити происходят из одной и той же молекулы ДНК (т.е. в гомодуплексах) равно 100%. Если же обе нити имеют разное происхождение (гетеродуплекс), то, в зависимости  от числа произошедших мутаций, число  комплементарных пар будет меньше 100%. Соответсвенно гетеродуплексы должны распадаться (плавится) при более  низкой температуре, чем гомодуплексы. Причем, чем ниже температура плавления, тем больше различия в двух последовательностях.

Температурная стабильность гибридной ДНК определяется температурой при которой 50% гибридной  ДНК диссоциировалось в одноцепочечную форму. Затем эта температура  сравнивается со средней температурой 50%-го плавления гомодуплексов обоих  типов последовательностей участвующих  в образовании гетеродуплекса, эта  температура обычно обозначается Tm. Разница между медианной температурой плавления гетеро- и гомодуплексов обозначается как dTm. Показана линейная зависимость dTm от числа неспаренных оснований ( Britten et. al., 1974 ): p=cdTm. Константа c обычно определяется условиями проведения эксперимента и обычно варьирует от 0.01 до 0.015. Определение dTm требует большого числа повторений, т.к. велика экспериментальная ошибка.

В качестве примера рассмотрим данные Какконе  и Пауэлла ( Caccone & Powell, 1989 ). Медианные температуры плавления гомодуплексов для человека и шимпанзе (pan panicus) составляют 59.50 и 59.12 градусов цельсия соответственно. Tm, таким образом, составляет 59.31. Значение же для гетеродуплексов составляет 57.59. Исходя из приведенной формулы получаем оценку числа нуклеотидных замен: 0.017 - 0.026 замен на нуклеотидную позицию.

Методика  блот-гибридизации РНК

Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.  
• 25 мМ трис-HCl, рН 8,5  
• Предгибридизационный буфер: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, денатурированная и обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося, 100 мкг/мл, 0,1% ДСН, 50% формамид. При работе с найлоновыми фильтрами концентрацию ДСН необходимо увеличить до 1%.  
• Гибридизационная смесь: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, денатурированная и обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося, 100 мкг/мл, 0,1% ДСН, 50% формамид, 10% дек-странсульфат, денатурированный меченый зонд. При работе с найлоновыми фильтрами концентрацию ДСН необходимо увеличить до 1% (о/о)  
• Буфер для отмывания 1: 2 х SSC, 0,1% ДСН Буфер для отмывания 2: 0,25 х SSC, 0,1 % ДСН  
• 20 х SSC  
• 20 х SSPE  
• 100 х раствор Денхардта

Методика  
1. Промывают фильтры в стерильной дистиллированной обработанной ДЭПК воде. Фильтры с РНК, денатурированной глиоксалем, необходимо подвергнуть тепловой обработке, чтобы удалить из РНК остатки глиоксаля. Для этого прогревают фильтры при 80 °С в течение 10 мин в 25 мМ трис-HCl, рН 8,5, а затем медленно охлаждают до комнатной температуры. Если РНК денатурировали формальдегидом/формамидом, то фильтры перед гибридизацией можно не обрабатывать.  
2. Помещают фильтр в пластиковый пакет, добавляют предгибридизационный буфер (из расчета 10 мл буфера на 100 см2 фильтра).

3. Выдавливают из  пакета все пузырьки воздуха,  запаивают его и проводят предгибридизацию, выдержав пакет между двумя  стеклами в течение 2—4 ч  при 42 С.  
4. Срезают один из углов пакета, сливают предгибридизационный буфер и заменяют его на гибридизационную смесь, содержащую денатурированный зонд (из расчета 4 мл смеси на 100 см2 фильтра). Для денатурации зонд можно просто выдержать в кипящей воде в течение 10 мин.  
5. Выдавливают из пакета все пузырьки воздуха и снова его запаивают. Проводят гибридизацию, выдержав пакет между двумя стеклами в течение 16—40 ч при 42 С.  
6. Осторожно, чтобы не повредить фильтр, вскрывают пакет и сливают гибридизационную смесь (ее можно использовать повторно). Если работают с изотопно меченными зондами, следует обеспечить их правильное хранение и захоронение радиоактивных отходов.

7. Один раз ополаскивают  фильтр в буфере для отмывания  1 и выдерживают в трех сменах  этого же буфера, по 5 мин в каждой  смене, при комнатной температуре,  
8. Промывают фильтр в трех сменах буфера для отмывания 2, по 5 мин в каждой смене, при комнатной температуре, затем в трех сменах того же буфера, по 30 мин в каждой смене, при 45-55 С.  
9. Промокают фильтр и заворачивают его в пластиковую пленку. 10.Выявляют гибридизовавшийся зонд радиоавтографическими (изотопная метка) или гистохимическими (неизотопная метка) методами.

- Чтобы предотвратить утечку радиоактивно меченных зондов, пакет с гибридизационной смесью необходимо поместить во второй пакет и тоже запаять его,  
- Жесткость условий, при которых проводят последние отмывания, можно повысить, уменьшив концентрацию SSC до 0,05 х (вместо 0,1 х). Чувствительность метода при этом обычно не снижается, поскольку при одних и тех же условиях Tm у ДНК—РНК- и РНК—РНК-гибридов выше, чем у гибридов ДНК—ДНК. 

Система   Sky View

Sky View - метод анализа и автоматической классификации хромосом по их спектральным свойствам. Метафазные хромосомы подвергаются комбинаторному окрашиванию пятью специфическими пробами ДНК, каждая из которых включает флуорохром. После такой обработки каждая из 24 хромосом человека приобретает уникальные флуоресцентные свойства, создаваемые комбинацией до пяти разных сигналов. Деконволюция флуоресцентных спектров хромосом проводится оптической системой Spectra Cube и программой анализа SKY View. 

На экране компьютера каждая хромосома показана в индивидуальном, легко различимом глазом цвете.  

Программа производит автоматическую классификацию  хромосом и обладает мощными возможностями  для редактирования, презентации  результатов анализа и поддержания  специализированной базы данных оптических образов. Технология абсолютно уникальна  и является признанным наиболее совершенным  и наиболее широко публикуемым методом  кариотипирования.

Стандартная технология SKY:  

Амниоцентез: с помощью  метода Sky было выяснено, что неидентифицированный при бандинге материал 11 хромосомы принадлежит хромосоме Y. Беременность благополучно завершилась рождением здорового ребенка. 

Система Spectral FISH 

Продукт компании ASI Spectral FISH совместно с программой SkyVision позволяет упростить многоцветный FISH-анализ благодаря одновременной детекции сигналов всех флуорохромов. Обеспечивает быстрый и точный анализ множества район-специфичных проб. Spectral FISH является частью Sky Vision, цитогенетической рабочей станции для анализа G-бэндинга, FISH и Sky (спектрального кариотипирования).

Система FISH View

Флуоресцентный  анализ гибридизации на хромосомах in situ с помощью системы FISH View 

 Система FishView – это пакет программ фирмы ASI для анализа флуоресцентной гибридизации на хромосомах in situ (FISH). Сочетает в себе простоту использования и мощные возможности анализа, такие как поддержка полного кариотипирования и количественная обработка.   

Система Fish View состоит из трёх основных программных компонентов:

·          База данных, общая для использования в Band View (анализ G-бэндинга), Sky View (спектральное кариотипирование),  Spektral FISH (спектральный анализ флуоресцентной хромосомной гибридизации in situ) и в других программах фирмы ASI.

·          Аквизиция (регистрация графической информации) – полностью автоматическая и быстрая, для работы с большими объёмами информации.

·          Анализ: высокий уровень контроля цвета, кариотипирование, количественная обработка.

Система BAND View

  Кариотипирование (G-бэндинг) с помощью системы Band View 

Система Band View значительно повышает эффективность кариотипирования методами G-, R-, Q- и DAPI-бэндинга за счет использования наиболее совершенных методов процессирования образов в цитогенетике. Система Band View cочетает в себе наиболее эффективные инструменты для кариотипирования, высокое разрешение оптического анализа образов, самые продуктивные алгоритмы. При желании система Band View может быть легко дооснащена до системы SKY™ (спектральное кариотипирование) – самой прогрессивной из существующих систем для кариотипирования. При этом основные элементы системы Band View (камера, микроскоп, база данных) могут быть включены в более совершенную систему SKY. 

Саузерн-блот гибридизация

Блоттингом (буквально - промакивание) называют перенос  фрагментов макромолекул (ДНК, РНК или  белка), разделенных с помощью  электрофореза в геле, на твердую  подложку - мембрану. В исследованиях  генома человека часто используют метод  блоттинга, разработанный Саузерном, при котором олигонуклеотидный  зонд, находящийся в растворе, гибридизуется  с ДНК, адсорбированной на мембране (Саузерн-блот гибридизация, Southern blot hybridization). Геномную ДНК (обычно выделенную из лейкоцитов или клеток плода) расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами ( рис. 65.6 ). Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть генома.

Значимость  метода для медицины обусловлена  возможностью исследовать определенный фрагмент геномной ДНК у любого человека.

Метод используют для выявления крупных перестроек в ДНК и некоторых точечных мутаций (большинство точечных мутаций  этим методом выявить нельзя).

Денатурация ДНК осуществляется с щелочью. После  окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в  котором двухчепочечные фрагменты  ДНК теряют связи и становятся одноцепочечными.

Перенос ДНК  с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр производится в буферном растворе. Непосредственно на поверхность  геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. За счет капиллярного эффекта  создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и  практически полностью оказывается  на его поверхности. После переноса одночепочечные нити фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре  точно соответствует их расположению в геле. 3. Для того чтобы визуально  выявить нужные фрагменты (фиксированная  на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченным радионуклидам  или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным  синтетическим зондом (такой зонд состоит из 16-30 пар осваний), или  клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.

При инкубации  фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибридизация комплементарных цепей ДНК зонда  и фрагмента на фильтре. Неспецифические  связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры.