Цитология мен гистологиядағы зертеу тәсілдері

     Цитология мен гистологиядағы зертеу тәсілдері.

Қазіргі кезде цитологияның зерттеу  тәсілдері мен әдістері әр алуан. Цитологиялық әдістерді оптикалық, цитофизикалық, ультрақұрылымды зерттеу, цитохимиялық, гистохимиялық және т.б. әдістерге топтастыруға болады. Клетка органоидтарының құрылысы, ультрақұрылымы мен функциясы жарық және электронды, қараңғы өрісті, фазалы-контрасты, поляризациялы, люминесцентті микроскопия және тағы басқа әдістер арқылы зерттеледі.  
Жарық және электронды, қараңғы өрісті, фазалы-контрасты, поляризациялы, люминесцентті микроскопия әдістері фиксацияланған клеткалардың құрылысы мен ультрақұрылымын зерттеуге қолданылатын болса, дифференциалды центрифугалаудың көмегімен алынған жеке органоидтар цитохимиялық, биохимиялық, биофизикалық және т.б. әдістермен зерттеледі.  

     Цитологияда негізгі қолданылатын әдістердің бірі – жарық микроскопы тәсілі. Жарық микроскопия әдістерінде объект арқылы жарық шоғы өтіп, объектив линзалар жүйесіне түсіп, алғашқы сурет пайда болады да, окуляр линзаларының көмегімен ұлғаяды.  
Оптикалық жүйе ретінде микроскоптың басты сипаты – шешушілік қасиеті, яғни бір-біріне жақын орналасқан екі объектіні жеке-жеке көрсету. Микроскоптың шешуші қабілеті жарық толқынның ұзындығымен есептеледі: толқынның ұзындығы неғұрлым қысқа болса, соғұрлым шешуші қабілеті жоғары. Жарық микроскопта көбінесе спектрдің көру облысындағы жарық көзі (400-700 нм) қолданылады, сондықтан бұл жағдайда микроскоптың максимальді шешуші қабілеті 200-350 нм-ден жоғарыламайды (0,2-0,35 мкм). Яғни жарық микроскопының шешуші қабілетінің соңғы деңгейі жарықты көру аймағын пайдаланғанда 0,2-0,3 мкм тең.  

     Қараңғы өрісті микроскопия. Қараңғы өрісте препараттарды арнайы конденсордың көмегімен қарастырады. Қараңғы өрісте бақылау кезінде объектіге жарық шоғының сәулелері түспейді, оның орнына шоқтың шеттік сәулелері қолданыс табады. Шеттік сәулелер объективке түспейді, сондықтан микроскоптың көру аумағы қараңғы болады да, шашыраңқы жарықпен көрінген объект ашық түсті болып көрінеді. Клетка препараттарында түрлі оптикалық тығыздықтағы құрылымдар болады. Жалпы қараңғы өрісте бұл құрылымдар түрлі жарықтандырулардың көмегімен анық көрінеді. Жарықтандыру кезінде жасушада жарық сәулелеріндегі шаңдарға ұқсас (Тиндаль эффектісі), өте ұсақ, кішкентай бөлшектер (0,2 мкм-нен кем) жарқырайды, шағылысқан жарық сәулесі микроскоп объективіне түседі.  
Бұл әдіс тірі клеткаларды зерттеуде жиі қолданылады.  
   

    Фазалы-контрасты (фазасы қарама-қарсы) микроскопия әдісі. Клетканың кейбір бөліктері жұқа болғанымен, бір-бірінен тығыздықтары мен жарықсындырғыштықтарымен ерекшеленеді, клеткалардың осындай қасиетіне фазасы қарама-қарсы микроскопия әдісі негізделген. Фазалы-контрастық микроскоптың объективіне арнайы пластинка қондырылған, сол пластинка арқылы жарық сәулесі тербеліс фазасының қосымша жылжуын сезеді. Суретті қалыптастыру кезінде бір фазада немесе қарама-қарсы фазада болатын, бірақ әр түрлі амплитудалы сәулелер өзара қарым-қатынасқа түседі, соның салдарынан объектінің ашық қою түсті контрасты суреті пайда болады. Фазалы контрасты микроскоптың ерекшелілігі – тірі клеткаларды, боялмаған объектілерді зерттеуге мүмкіндік береді.  
  

      Интерференциялы микроскопия әдісі жарықтың екі полярланған сәулелерінің бірі объект арқылы, енді біреуі объектінің қасынан өтуіне негізделген. Бұл жағдайда бірінші сәуленің фазасының кешігуі туындайды. Осы сәулелердің қабаттасуы (интерференциясы) суреттің пайда болуын туғызады. Егер екі полярланған сәулелердің екі толқынының аралығындағы арақашықтық толқын ұзындығының толық санына тең болса, сурет ақшыл өрісте қара түсті дақ ретінде көрінеді, ал егер де екі толқын арасындағы арақашықтық жартылай толқындардың тақ санына тең болса, сурет қараңғы өрісте ақшыл дақ ретінде суреттеледі.  
Интерференциялы микроскопта сәулені екі перпендикуляр жазықтықта поляризациялау конденсордың фокальды жазықтығында орналасқан поляризатор мен кварцтан жасалған Волластон призмасының көмегімен жүреді. Волластонның екінші призмасы осы екі сәулені объективтің артқы фокальды жазықтығында жинақтайды.  
Интерференциялы микроскоп көмегімен тірі объектілерді бақылауға болады, сондай-ақ клетка құрылымдарының құрғақ салмағы, клеткадағы құрғақ затпен судың концентрациясы, құрылымдардың қалыңдығы туралы мәліметтер алуға болады. Мұндай мәліметтер алу үшін микроскоптың тубусының жоғарғы жағында орналасқан компенсатор қолданылады.  
Рентген сәулелерін сіңіру тәсілі. Әр түрлі заттар толқындардың белгілі бір ұзындықтарында рентген сәулелерін әр қалай сіңіреді, міне осы қасиетке рентген сәулелерін сіңіру әдісі негізделген. Спектрорентгенограмма көптеген заттар үшін белгілі. Рентген сәулелерін ұлпадан жасалған препарат арқылы өткізе отырып, сіңіру спектрі көмегімен оның химиялық құрамын анықтауға болады. Осы әдістің көмегімен микрофотографиялардан клеткадағы құрғақ заттардың құрамы анықталады. Фотосуретке түсіретін құрылымда заттың концентрациясы неғұрлым көп болса, соғұрлым эмульсия аз жарқырайды. Сіңірілуші заттың концентрациясы сол заты бар құрылымның суретінің қараюымен анықталады. Оптикалық тығыздық формуланың көмегімен есептелінеді.  

       Флуоресценциялық микроскопия. Тірі клеткаларды зерттеуге флуоресценциялы бояғыш заттар және флуоресценциялық микроскопия әдісі кеңінен қолданылады. Бұл әдістің негізінде кейбір заттардың ультракүлгін сәулелерінде флуоресценциялану қасиеті жатыр. Мұндай флуоресценцияны ұлпадан шығаруға болады, ол үшін ұлпа арқылы ультракүлгін сәулелерінің шоғын өткізу керек. Бұл мақсатта конденсорда жалпы жарық шоғынан көк және ультракүлгін сәулелерді бөлетін жарық фильтрі орналасқан арнайы ультракүлгінді микроскоп қолданылады. Бақылаушының көзінің алдында орналасқан басқа жарық фильтрі препарат шығаратын флуоресценция сәулелерін өткізе отырып, көк және ультракүлгін сәулелерді сіңіреді. Жарық көзі ретінде күшті ультракүлгін сәулесін бөлетін сынап шамдары және қыздыру шамдары қолданылады.  
Жарық энергиясын сіңіру кезінде бірқатар заттарға жарқырау (флуоресценттік, люминесценттік) қасиеті тән. Флуоресценция спектрі флуоресценцияны қоздыратын сәулелерге қатысты үлкен толқындар жағына қарай ығысады. Бұл принцип қысқа толқындардың аймағында флуоресценциялаушы объектілері анықталып, қарауды қамтамасыз етеді. Мұндай микроскоптардың көкшіл-күлгін аймағында жарық беретін фильтрлер пайдаланылады.  

         Цитологиялық зерттеулерде ультракүлгін люминесцентті микроскоптар да пайдаланылады. Бұл әдісте тірі клеткаларға флуоресценттеуші заттарды енгізеді. Ол заттар клетканың белгілі бір құрылымдарымен байланысқа түсіп, олардың қайта люминесценциялануын туғызады.  
Ультракүлгін микроскоптарында жеке флуоресценциялы объектілерді бақылауға болады.  
     Радиоавтография әдісі клеткадағы зат алмасу үрдісін зерттеуде қолданылады. Ол үшін фосфор, көміртегі, сутегі радиоактивті элементтер немесе олардың қосындылары пайдаланылады. Зерттеліп отырған ортаға немесе ағзаға метоболизм үрдісі кезінде, жасушалармен сіңірілетін радиоактивті изотоп енгізіледі. Изотоптардың радиоактивті сәулеленуі салдарынан олардың орныққан жерін анықтауға болады. Бұл әдісті қолдану кезінде клеткалардың жұқа кесінділерін үлбірге салады. Радиоактивті изотоптар бар жерлерде үлбір қараяды.  
Изотопты енгізгеннен кейін біраз уақыт өткеннен соң, яғни метоболизмнің белгілі бір кезеңдері өткеннен кейін препарат даярланады. Заттардың таралуы нақты анықталады. Заттардың тек қана клеткада емес, сондай-ақ клетка мембраналарына орналасуларын анықтауда бұл әдістің мәні зор.  
Поляризациялық микроскоптың көмегімен изотропты объектілерді (бөліну ұршығының талшықтарын, микрофибрилдерді және т.б.) зерттейді.  
Мұндай микроскоптың конденсорының алдында поляризатор орналастырылады, ол белгілі полярлану жылдамдығы бар жарық толқындарын өткізеді. Препарат пен объективтен кейін полярланудың сол жазықтығымен жарық өткізе алатын анализатор орналастырылады. Қиысқан призмалар ортасында сәулені екі есе сындыратын объекті орналасқаннан кейін, объект қараңғы аумақта жарқырап көрінеді. Поляризаторлық микроскоп көмегімен өсімдік клеткасының қабықшасында мицеллийлердің орналасуын қарастыруға болады.  

        Рентген сәулелерін дифракциялау әдісі. Рентген сәулелері кристалдар арқылы өткен кезде дифракцияға ұшырайды. Олардың осы қасиеті рентген сәулелерін дифракциялау әдісінің негізін қалайды. Егер кристалдардың орнына биологиялық объектілер, мысалы, сіңір, целлюлоза немесе тағы басқа объектілерді қолданған кезде, олар тура сондай дифракцияға ұшырайды. Бұл жағдайда экранда немесе фотоүлбірде дақтар мен жолақтардан түзілген сақиналар қатары пайда болады.  
Дифракция бұрышы объектідегі молекулалар мен атомдар топтарының арақашықтығымен анықталады. Құрылымдық бірліктер арасындағы қашықтық неғұрлым алшақ болса, дифракция бұрышы соғұрлым аз болады, немесе, керісінше, зерттеліп отырған заттың атомдары мен молекулаларының арасындағы арақашықтық аз болса, дифракция бұрышы үлкен болады. Ал экранда бұл қара түсті зоналар мен орталықтар арақашықтықтарына сәйкес келеді.  
Бұл әдістің атомдар мен молекулалардың топтарының кеңістікте таралуын анықтауда және заттың ішкі құрылымы туралы мәлімет алуда мәні зор.  

       Электронды микроскопия әдісі. Электронды микроскоптың құрылысы жарық микроскоп тәрізді, бірақ жарық шоғының ролін электронды шоқ атқарады, бұл шоқ линзалармен емес, электромагниттермен фокусталады. Дегенмен, электрондар шоғы үшін толқындар ұзындығы, көзге көрінетін жарық толқындар ұзындығына қарағанда неғұрлым қысқа, осы қасиеті электронды микроскоптың шешуші қабілеттілігін арттырады. Қазіргі электронды микроскоптардың шешуші қабілеті – 0,2-1 нм.  
Электронды микроскоптың астында тірі емес объектілер, яғни препараттар қарастырылады. Объектілер тірі ағзалардың өлуін тудыратын вакуумға салынады. Вакуумда электрондар шашырамай объектіге бірден түседі.  
Электронды микроскоптан қарастырылатын объектілердің жұқалығы 400-500 Å-нен қалың болмауы тиіс. Сондықтан жұқа препараттарды даярлау үшін ультрамикротом қолданылады.  
Вирустар, фагтер, нуклеин қышқылдары, жұқа мембраналар сияқты биологиялық объектілердің электрондарды шашырататын қасиеттері бар. Олардың контрастылығын ауыр металдармен – алтын, платина, хроммен шаңдату арқылы күшейтеді.  
Контрастылықты (қарама-қарсылықты) осмий немесе вольфрам қышқылдарының және ауыр металдардың кейбір тұздарымен күшейтеді, олар препараттың кейбір жеке бөліктерімен қосылыстар түзе алады. Аталған заттар препаратқа фиксациялау немесе бояу кезінде енгізіледі.  
Аталмыш әдіс құрылымдарды субмикроскопия (макромолекулалар) деңгейінде зерттеуді қамтамасыз етеді.  
Трансмиссионды электронды микроскопта электрондар жарық микроскопындағы объект арқылы өтетін жарық секілді өтеді. Нәтижесінде, электрондар шоғы фотография тақтасында объектінің суретін көрсетеді. Электрондар жақсы өту үшін объект кесінділері өте жұқа болуы тиіс.  
Сканерлеуші микроскопта электрондар объектінің бетімен шағылысады да, кері бағытта қозғалу кезінде суретті береді. Сканерлеуші микроскоптың шешуші қабілеті трансмиссионды электронды микроскопқа қарағанда төмен. Сканерлеуші микроскоптың көмегімен қабығы қатты кейбір ағзаларды тірі күйінде зерттеп, кейбір тіршілік иелерінің жабынының ұсақ детальдарын көрсететін тамаша фотосуреттер алуға болады.  
Ақырғы бейненің нақтылығын күшейту үшін барлық объектілерді бояйды. Жарық микроскопында бояғыш заттарды, ал трансмиссионды электронды микроскопында құрамында электрондарды сіңіруге қабілетті ауыр металдары бар фиксаторлар (мысалы, осмийдің төрт тотығы, калий перманганат, қорғасын) қолданады. Сканерлеуші электрондық микроскоп үшін мұзбен жабылған бет алуға материалды жиі тоңазытады. Бұл жағдайда суда еритін заттардың суды жоғалтулары тоқтайды, сонымен қатар құрылымдардың химиялық құрамының өзгерулері азаяды. Электрондық микроскоптың көмегімен фиксациялайтын заттардың әсерінен цитоплазманың қозғалғыштығын тоқтату сәтінде жасушаның статикалық күйі зерттеледі.  
Жануарлар клеткалары мен ұлпаларын зерттеу үшін клетка өсінділері (культуралары) әдісі пайдаланылады. Кейбір ұлпаларды жеке-жеке клеткаларға бөлгеннен кейін, жекеленген клеткалар өз тіршіліктерін жалғастырады, тіпті көбею қасиетін жоғалтпайды. Эмбрион немесе кейбір жеке клеткалар қолайлы ортада ағзадан тыс өсіп, көбейе алатындығын алғаш рет американ эмбрилогы Р. Гаррисон (1879-1959) дәлелдеген. Клетканы культуралау техникасын әрі қарай дамытқан француз биологы А. Каррель (1873-1959) болды.  
Бұл әдістің ең қарапайым тәсілі келесідей: қоректік ортаға толы камераға тірі ұлпаның кесегі салынады. Біраз уақыт өткеннен кейін ұлпа кесегінің шетіндегі клеткалар бөлініп өсе бастайды. Өзге жағдайда ұлпаның кесілген кішкентай кесегі трипсин ферменті немесе хелатон версен ферменті ерітінділерімен сәл өңделеді, бұл клеткалардың толық бытырап кетуіне әкеп соғады. Содан соң клеткаларды шайып қоректік ортаға салады, онда клеткалар тұнбаға түседі де, шыныға жабысып көбейе бастайды, алдымен олар колониялар түзеді, соңынан клеткалық қабат түзеді. Осылай тірі кезінде бақылауға ыңғайлы, бірқабатты клеткалар өсіндісі алынады. Өсінді өсіру кезінде қоректік ортадан басқа температура, стерильділік сияқты факторлар ескерілген жөн. Культурада өсімдік клеткаларын өсіруге болады. Қазіргі кезде ағзадан тыс клеткаларды өсіру тек қана цитологиялық зерттеулерде қолданылмай, сондай-ақ генетикалық, вирусологиялық, биохимиялық зерттеулерде де қолданылады.  
Тірі клеткаларды бақылау көбінесе фотосуреттерге түсіру арқылы тіркеледі. Бұл әдісте микроскопқа түрлі фотоқондырғылар қондырылады. Тірі клетканы кинопленкаға да түсіруге болады. Ол үшін жылдамдатылған немесе баяулатылған кинотүсіру (цейтраферлік түсіру) жүргізіледі. Бұл жағдайда клеткалардың бөлінуі, фагоцитоз, цитоплазманың қозғалысы, кірпікшелердің жылжуы сияқты маңызды үрдістерді бақылауға болады.  
Дегенмен клетканың құрылымы мен қызметі туралы мәліметтер фиксацияланған клеткалардан көбірек алынады. Фиксацияның мәні – клеткаларды өлтіру, клеткаішілік ферменттердің белсенділігін тоқтату, клетка компоненттерінің ыдырауын тоқтату, сондай-ақ, құрылымдар мен заттарды жоғалтпау, тірі клеткаларға тән емес құрылымдардың пайда болуына жол бермеу. Фиксаторлар ретінде альдегидтер, олардың басқа заттармен қосындысы, спирттер, сулема, осмийдің төрт тотығы қолданылады. Фиксацияланған объектілер соңынан боялады. Бояу үшін түрлі табиғи (гематоксилин және кармин, т.б.) және синтетикалық бояулар қолданылады. Мүше жасушаларын бояу үшін кесінділер жасалуы қажет. 5-10 мкм-ге дейінгі кесінділер микротомда дайындалады.  
Цитологияда түрлі биохимияның аналитикалық және препаративті тәсілдері пайдаланылады.  

       Микрохирургия әдісінде микроманипулятордың көмегімен клетканың жеке бөлімдерін алып тастауға, жаңа бөлімдер қосуға немесе қандай да болсын өзгеріс енгізуге болады. Амебаның ірі клеткасының негізгі үш компоненті –клетка мембранасы, цитоплазма және ядро бөліп алып, соңынан қайта жинап тірі клетка алуға болады. Осындай жолмен амебаның бірнеше особінен жиналған құрамды клетка алуға болады.

Клетканың жалпы морфологиясын окып-үйрену зерттеу әдістерінің дамуына тығыз байланысты. Гистологиядағы негізгі зерттеу әдісі — клеткаларды, үлпалар мен органдарды микроскопиялау. Қазіргі кездін өзінде де жарык микроскопы зерттеу құралы ретінде өзінің маңызын жойған жоқ. Бірак та тірі материал өзінің мөлдір және жеке клеткалардың қалың болуына байланысты зерттеуге қолайсыз. Сондыктан көбінесе фиксацияланған (бекітілген) материалмен жүмыс істелінеді. Одан жүка кесінділер дайыңдап, оларды түрлі бояғыштармен бояиды. Қалындығы 5-10 мкм кесіндіні арнаулы қүрал микротом арқылы дайындайды. Сапалы бекіткіш объектінің тірі күйіндегі күрлымьш көп өзгертпейді. Бекіткіш үлпаны тығыздайды және автолиз процестерін токтатады. Кейбір бекіткіш сүйықтар белгілі күрылымдардын бояулармен боялу қабілетін арттырады.

Жиі қолданылатьш бекіткіштер: формальдегид, қосхромдық қышқыл калий, сірке, пикрин және осмий қышқылдары мен этил спирті. Жақсы бекіткіш сүйықтардың қоспалары көпшілігі оларды үсьшған зерттеушілердің аттарымен аталған (Буэнің, Карнуаның қоспалары). Бекіткеннен кейін объектіні үлпаға сіңетін ортаға батырады (мысалы, целлоидин немесе парафин). Осы тығыздаушы заттар жаксы сіңу үшін үлпанын бөлшегінен этил спиртінін көмегімен суды ығыстырып шығарады, содан кейін кислолға немесе толуолға салады. Алдьш-ала істелетін бұл екі кезең үлпаға парафин сіңу үшін қажет. Жылы сүйық парафин үлпаға сіңеді де, қатып калады. Микротомнын көмегімен парафин блогынан шыныға бекитін жүқа кесінділер дайындалады. Кесінділерден парафинді ксилолдың көмегімен шығарады. Осыдан кейін кесіндіні бояиды. Көбінесе ұлпаны гематоксилинмен және эозинмен бояиды. Гематоксилинмен боялатын құрылымдар-ды базофильдік деп атайды. Эозинкышқыл бояу байланыстыратьш клетканың компоненттерін ацидофильдік немесе эозинфильдік дейді. Бүл күрылымдарды тірі клеткада белсенділік    күйінде    көру    үшін    әр    түрлі    микроскоптар шығарылған: фаза-контрастық, поляризациялық, флуоресценттік, тағы басқалары. Бұл микроскоптардың бәрі жарықты пайдалануға негізделген. Соңғы кезде электрондык микроскоп та кен қолданылып жүр.

Электронды микроскопты 1931 жылы Девиссон мен Калбек Германияда шығарған. Клетканың біршама анық көрішсін Руска мен Кнолль 1934 жылы алған болатын. 1950 жылы алғаш рет ультражұқа кесінділер алынған. Электронды микроскопқа препарат дайындайтын қүралды ультрамикротом деп атайды. Электронды микроскоптың көрсету мүмкіндігі өте жоғары. Электронды микроскоп жа-рық микроскопына қарағанда клетканы 100000 есе артық үлкейтеді. Қазіргі электронды микроскоптың керсеткіштік мүмкіндігі 0,1-0,3 нм-ге дейін жетеді. Клетканың барлық ультрақұрылысын молекулалық деңгейде зерттеуге мүмкіншілік береді. Электронды микроскопта жарық сәулесінің орнында электрондар ағысы қолданылады. Жарық микроскопындағы объектив пен окулярдың ролін электронды микроскопта электромагниттік линзалар атқарады. Сөйтіп объектішң бейнесі экранға түседі.