Біотехнологія ферментів

     Розглянемо кілька прикладів. Фермент ліпаза майже не синтезується грибом Aspergillus awamori на середовищі без індуктора, додавання жиру кашалота підсилює біосинтез ферменту в сотні разів. При додаванні ж у середу крохмалю і при повному виключенні мінерального фосфору інтенсивно синтезується фосфатаза. Не тільки наявність індуктора здатне збільшувати вихід ферменту. Важливу роль відіграє склад живильного середовища та умови культивування. При розробці процесу біосинтезу α-амілази культурою Aspergillus oryzae заміна сахарози (як джерело вуглецю) на крохмаль збільшила активність ферменту в 3 рази, додавання солодового екстракту (з пророслого насіння злакових) ще в 10 раз, а підвищення концентрації основних елементів живильного середовища на 50% - ще в 2 рази.

     Для інтенсифікації процесу росту і  синтезу ферментів додають різні  чинники зростання, наприклад, амінокислоти, пуринові основи та їх похідні, РНК  та продукти її гідролізу. Як джерело  вуглецю використовують крохмаль, кукурудзяний екстракт, соєве борошно, гідролізати  біомаси дріжджів. Мікроорганізми можуть утилізувати і мінеральні джерела  азоту. До складу поживних середовищ  входять і іони Mg, Mn, Zn, Fe, Cu та ін металів. Механізм дії більшості з них невідомий. Деякі входять до складу ферменту. Іони Ca підвищують стійкість α-амілази, іони Fe і Mg активізують і стабілізують протеолітичні ферменти.

     Оптимальний склад живильного середовища для кожного продуцента може бути визначений двома способами: емпіричний і побудова математичної моделі з використанням комп'ютера. Останній, звичайно, краще. За характером культивування всі технологічні процеси виробництва ферментних препаратів діляться на дві великі групи: глибинний і поверхневий методи.

     3. Глибинний метод виробництва ферментів

     У цьому випадку мікроорганізми вирощуються у рідкому поживному середовищі. Технічно більш досконалий, ніж поверхневий, так як легко піддається автоматизації та механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні звичайно значно нижча, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.

     При глибинному культивуванні продуцентів ферментів виділяють, як і в будь-якому біотехнологічному процесі, 5 етапів.

     1. Приготування поживних середовищ залежить від складу компонентів. Деякі попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обнасінення об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації та апарати. Повітря очищається до і після аерації. До – тому, що містить частинки пилу органічної та неорганічної природи, після – тому, що несе клітини продуцента.

     2. Отримання посівного матеріалу. Для посіву живильного середовища матеріал готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів – це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій – молода зростаюча культура на початковій стадії спороутворення. Отримання посівного матеріалу полягає у збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується тільки вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне спороношення - скорочується до 1%.

     3. Виробниче культивування. Біосинтез ферментів у глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервній подачі повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах може гальмувати зростання біомаси продуцента, тому часто свіже середовище або деякі його компоненти вводяться у ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32^оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворених метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять у комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкраща якість продуктів.

     4. Виділення. У міцелії тридобової культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в оточуюче клітини рідке середовище. У цьому випадку препарати ферментів виділяють з фільтратів після відділення біомаси.

     5. Отримання товарної  форми.  
 

     4. Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів 
 

     При поверхневому методі культура росте  на поверхні твердого зволоженого живильного середовища. Міцелій повністю обволікає  і досить міцно скріплює тверді частинки субстрату, з якого отримують  поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середовище повинно бути пухким, а шар культури-продуцента невеликим.

     Вирощування виробничої культури відбувається зазвичай в асептичних умовах, але середовище та кювети необхідно простерилізувати. Перед кожним новим завантаженням  також необхідна стерилізація устаткування.

     Переваги  поверхневої культури: значно більш  висока кінцева концентрація ферменту на одиницю маси середовища (при  цукруванні крохмалю 5 кг поверхневої  культури замінюють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.

     Посівний матеріал може бути трьох видів:

     - культура, що виросла на твердому живильному середовищі;

     - споровий матеріал;

     - міцеліальна культура, вирощена глибинним способом.

     У три етапи отримують і посівну культуру. Спочатку музейну культуру продуцента пересівають на 1 – 1,5 г зволожених стерильних пшеничних висівок в пробірку і вирощують в термостаті до рясного спороутворення. Другий етап - аналогічний, але в колбах, третій - у посудинах з 500 г середовища.

     Основу живильного середовища становлять пшеничні висівки, як джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до висівок можна додавати буряковий жом, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середовище гострим паром при помішуванні (температура – 105-140⁰ С, час 60-90 хвилин). Після цього середовище засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають в розтільні камери. Культивують протягом 36-48 годин.

     Зростання ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій і їх проростання (температура не нижче 28^оС), потім ріст міцелію у вигляді гармата сірувато-білого кольору (необхідно виводити тепло, що виділяється) і утворення конідій. Для створення сприятливих умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримання оптимальної вологості (55-70%).

     Вирощена в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура представляє корж з набряклих часток середовища, щільно зв'язаних зрощеним міцелієм. Масу подрібнюють до гранул 5,5 мм. Культуру висушують до 10-12% вологості при температурі не вище 40^оС, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - в шкіряній та спиртовій промисловості. У харчовій і особливо медичній промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.

     Схема очищення зводиться до наступного:

     - звільнення від нерозчинних речовин;

     - звільнення від супутніх розчинних речовин;

     - фракціонування (як правило, хроматографічними методами).

     Для виділення ферменту з поверхневої культури необхідна екстракція. Як правило, екстраген – вода. При цьому в розчин переходять цукри, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення і очищення завершує сушка. Після сушіння препарат повинен містити не більше 6-8% вологи, тоді він може в герметичній упаковці зберігатися до одного року без втрати активності.

     Стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін.

     Враховуючи величезні перспективи застосування ферментних препаратів в різних галузях промисловості і сільського господарства, медицини, можна зробити висновок про необхідність розширення досліджень у цій області для оптимізації технології та гарантійного отримання високоактивних і стабільних препаратів мікробних ферментів. 

     5. Загальна характеристика іммобілізованих ферментів

     Іммобілізовані ферменти (від лат. Immobilis - нерухомий) - це препарати ферментів, молекули яких пов'язані з матрицею, або носієм (як правило, полімером), зберігаючи при цьому повністю або частково свої каталітичні властивості. Іммобілізовані ферменти зазвичай не розчиняються у воді; між двома фазами можливий обмін молекулами субстрату, продуктів каталітичної реакції, інгібіторів і активаторів.

     У сучасній біотехнології одне з важливих місць належить ферментам. Ферменти та ферментні системи широко використовуються в різних галузях промисловості, медицині, сільському господарстві, хімічний аналіз та т.д.

     Ферменти – речовини білкової природи і тому нестійкі при зберіганні, а також чутливі до теплових впливів. Крім того, ферменти не можуть бути використані багаторазово через труднощі у відділенні їх від реагентів та продуктів реакції. Вирішити ці проблеми допомагає створення іммобілізованих ферментів. Початок цьому методу було покладено в 1916 році, коли Дж.Нельсон і Е.Гріффін адсорбували на вугіллі інвертазу і показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність. Сам термін “іммобілізовані ферменти” узаконений в 1971 році, і означає будь-яке обмеження свободи пересування білкових молекул в просторі.

     Сутність іммобілізації ферментів – прикріплення їх у активній формі до нерозчинної основи або проникнення в напівпроникну мембранну систему. Прикріплення ферменту до носія здійснюється адсорбційно, хімічним зв'язком або шляхом механічного включення ферменту в органічний або неорганічний гель (в капсулу і т. п.). При цьому допускається прикріплення ферменту тільки за рахунок функціональних груп, що не входять в активний центр ферменту і не беруть участь в утворенні фермент-субстратного комплексу. Носій ферменту або матриця може мати вигляд зернистого матеріалу, волокнистої структури, пластинчастої поверхні, плівок або тканин, порожніх волокон, трубочок, капсул і т. д. Має значення розмір частинок носія. Важливо мати велику поверхню, тому рекомендуються невеликі частинки діаметром 0,1-0,2 мм. Носій ферменту може бути як природна речовина, так і синтетичний полімер.

     Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними попередниками:

     1. Гетерогенний каталізатор легко відділяється від реакційного середовища, що дає можливість зупинити реакцію в будь-який момент, використовувати фермент повторно, а також одержувати чистий від ферменту продукт.

     2. Ферментативний процес з використанням іммобілізованих ферментів можна проводити безперервно, регулюючи швидкість каталізуємої реакції і вихід продукту.

     3. Модифікація ферменту цілеспрямовано змінює його властивості, такі як специфічність (особливо щодо макромолекулярного субстрату), залежність каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища, стабільність до денатуруючих впливів.

     4. Можна регулювати каталітичну активність іммобілізованих ферментів шляхом зміни властивостей носія дією фізичних факторів, таких як світло і звук. Іммобілізувати ферменти можна як шляхом скріплення на нерозчинних носіях, так і шляхом внутрішньомолекулярного або міжмолекулярного зшивання білкових молекул низькомолекулярними біфункціональними сполуками, а також шляхом приєднання до розчинного полімеру.

     6. Методи іммобілізації ферментів

     Існує два основні методи іммобілізації ферментів: фізичний та хімічний.

     Фізична іммобілізація ферментів являє собою включення ферменту в таке середовище, в якому для нього доступним є лише обмежена частина загального обсягу. При фізичній іммобілізації фермент не пов'язаний з носієм ковалентними зв'язками. Існує чотири типи зв'язування ферментів:

     - адсорбція на нерозчинних носіях;

     - включення у пори гелю;

     - просторове відділення ферменту від решти об’єма реакційної системи за допомогою напівпроникної перегородки (мембрани);

     - включення в двофазне середовище, де фермент розчинний і може знаходитися тільки в одній з фаз.

     Перераховані підходи проілюстровані рис. 2.

     

     Рис. 6.1 Способи іммобілізації ферментів: а - адсорбція на нерозчинних носіях; б – включення у пори гелю; в – відділення ферменту за допомогою напівпроникної мембрани; г – використання двохфазного реакційного середовища.