Біотехнологія ферментів

     ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД

     “ЗАПОРІЗЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ”

     МІНІСТЕРСТВО  ОСВІТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ

     КАФЕДРА ЗАГАЛЬНОЇ ТА ПРИКЛАДНОЇ ЕКОЛОГІЇ І  ЗООЛОГІЇ 
 
 
 
 

ІНДИВІДУАЛЬНЕ ЗАВДАННЯ

з курсу  “Промислова мікробіологія” 

Біотехнологія ферментів 
 

Виконав: студентка  

       групи 4118-1б

      Єгорова Ю.В.

       Перевірив:       
 
 
 
 

Запоріжжя

2011 
ЗМІСТ

ВСТУП……………………………………………………………………………….3

1. Використання ферментів у промисловості……………………………………4

2. Класифікація ферментів………………………………………………………….5

3. Глибинний метод виробництва ферментів…………………………………….11

4. Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів……12

5. Загальна характеристика іммобілізованих ферментів……………………….15

6. Методи іммобілізації ферментів………………………………………...…….17

ВИСНОВКИ………………………………………………………………………23

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ.……………………………………24 
 
 

 

     ВСТУП 
 

     Ферменти — це біологічні каталізатори, які дозволяють скоординувати хімічну активність в клітинах. Не дивлячись на те, що ферменти використовуються людиною все тисячі років, лише в кінці XIX ст. ми почали розуміти, як вони працюють. Зараз ми знаємо, що ферменти — це складні білкові молекули зі специфічною тривимірною конфігурацією, і що їх структура закодована в ДНК. Число можливих конфігурацій може бути безкінечно великим.

     У майбутньому відкриваються широкі можливості для конструювання нових ферментів. Одна з них - спрямована зміна окремих амінокислот шляхом зміни генів, які кодують ферменти. Ми все глибше пізнаємо закони, за якими білки беруть специфічну тривимірну конфігурацію, тому не виключена поява в найближчому майбутньому абсолютно нових сконструйованих ферментів. Цей напрямок називається білковою інженерією. Крім того, чим більше ми дізнаємося про те, як працюють ферменти, тим більш імовірно, що ми зможемо сконструювати небілкові або частково небілкові каталізатори, які набагато стабільніша, ніж звичайні ферменти. Можливо, саме цей напрям буде найпривабливішим для підприємців. Серед напрямків, які окупляться негайно, - пошук природних ферментів, що є більш досконалою альтернативою використовуваним в даний час. Все це вимагає величезних інвестицій у дослідження та розробки. 
 
 
 
 

     1. Використання ферментів у промисловості 
 

     Для промисловості ферменти цікаві з  двох основних причин. По-перше, завдяки  своїй різноманітності ферменти потенційно здатні каталізувати безліч промислово важливих хімічних реакцій. По-друге, вони набагато ефективніші і специфічніші, ніж неорганічні каталізатори, які зазвичай використовуються. При нормальних температурах і тиску в їх присутності здійснюються реакції, які зазвичай вимагають дуже високих температур і тиску. Наприклад, в одному з найбільших у світі промислових виробництв, заснованому на методі Хабера, аміак отримують із газоподібних азоту і водню при температурі 500 ° С і високому тиску. Азотфіксуючі бактерії здатні синтезувати аміак з атмосферного азоту і водню при кімнатній температурі і нормальному атмосферному тиску за допомогою ферментів та використовуючи АТФ як джерело енергії. Якби вдалося розробити технологію отримання амонію за допомогою ферментів, можна було б зберегти дуже багато енергії. Ще однією перевагою ферментів є їх специфічність, яка дозволяє отримувати дуже чисті продукти, що особливо важливо для фармакологічної, харчової та сільськогосподарської промисловості.

     Використання  ферментів має і ряд недоліків, пов'язаних головним чином з нестабільністю білків, виділених з клітин. Такі білки легко денатурують при зміні температури і рН, і при дії органічних розчинників, які використовуються у виробничих процесах. Вони також можуть бути інгібованими продуктами реакції. Недоліком є ​​також висока вартість процесів виділення самих ферментів і необхідність використання для цього «безпечних» (наприклад, непатогенних) організмів, особливо, якщо ферменти призначені для одержання продуктів, які споживаються тваринами і людиною. В даний час використовується менше 200 ферментів з 2500 виділених та описаних (які в свою чергу складають лише 10% загального числа виявлених в природі). Більшість ферментів виділено всього лише з одинадцяти видів грибів, чотирьох видів дріжджів і восьми видів бактерій. 

       

                                                Рис. 1.1 Просторова структура

     молекули глюкоамілази із

     Aspergillus awamori 
 
 
 
 
 

     Зараз ферменти у виробничому процесі  використовують багато фармацевтичних компаній, виробники сиру, пива і  вина, виробники детергентів, текстилю, фруктових соків і т. п. Рівень світового продажу ферментів  в даний час перевищує 1 млрд. доларів  на рік.  
 

     2. Класифікація ферментів 
 

     Класифікація ферментів заснована на механізмі їх дії і включає 6 класів:

     1) Оксиредуктази – каталізують окисно-відновні реакції:

     а) дегідрогенази – ферменти, які переносять водень із одного субстрату на інший;

     б) оксидази – ферменти, які переносять водень із субстрату, який окислився  на інший.

     2) Трансферази – ферменти, які прискорюють перенос атомів або груп атомів, радикалів з одного субстрату на інший:

     а) метилтрансферази – ферменти, які переносять метильну групу з одного субстрату на інший;

     б) ацетилтрансферази – ферменти, які переносять кислотні залишки з одного субстрату на інший;

     в) амінотрансферази – ферменти, які  переносять аміногрупи з одного субстрату  на інший;

     г)фосфотрансферази – ферменти, які переносять залишки фосфорної кислоти з одного субстрату на інший;

     д) сульфідтрансферази – ферменти, які переносять залишки сульфогрупи з одного субстрату на інший;

     е) амідинтрансферази – ферменти, які переносять залишки аміди нової групи з одного субстрату на інший.

     3) Гідролази – ферменти, які каталізують за участі води; розщеплюють складні органічні сполуки по ефірному або пептидному зв’язку:

     а) естерази – ферменти, які каталізують  гідроліз складних ефірів;

     б) гідролази фосфомоно- та диефірів – ферменти, які каталізують відщеплення фосфорної кислоти від різних сполук;

     в) глюкозидази – ферменти, які приймають участь в гідролізі глюкозидів;

     г) пептидази – ферменти, які каталізують розщеплення білків, дипептидів, що містять подвійний зв'язок;

     д) амідази – ферменти, які каталізують  відщеплення аміногрупи за допомогою  води у амідів, нуклеотидів та інших сполук;

     е) поліфосфатази – ферменти, які гідролізують фосфоангідридні зв’язки.

     4) Ліази – ферменти, які не гідролітичним шляхом відщеплюють ту чи іншу групу або розривають С-С зв'язок.

     5) Ізомерази – ферменти, які каталізують реакції внутрішньо молекулярного переміщення різних груп.

     6) Лігази (синтетази) – ферменти, які каталізують реакції біосинтезу за рахунок енергії АТФ або інших нуклеозидтрифосфатів.

     Ферменти  як біокаталізатори мають ряд  унікальних властивостей, наприклад, таких  як висока каталітична активність і  вибірковість дії. У ряді випадків ферменти мають абсолютну специфічність, каталізує перетворення тільки однієї речовини. Для кожного ферменту існує свій оптимум рН, при якому його каталітична дія максимальна. При різкій зміні рН ферменти інактивуються через незворотну денатурацію. Прискорення реакції при підвищенні температури також лімітоване певними межами, оскільки вже при температурі 40-50^оС багато ферментів денатурують. Ці властивості ферментів доводиться враховувати при розробці технології нового препарату.

     Оскільки  ферменти – речовини білкової природи, в суміші з іншими білками їх кількість  визначити практично неможливо. Наявність ферменту в препараті  може бути встановлено лише за протіканням  тієї реакції, яку каталізує фермент. При цьому кількісну оцінку вмісту ферменту можна дати, визначивши або кількість утворених продуктів реакції, або кількість витраченого субстрату. За одиницю активності ферменту приймають ту його кількість, яка каталізує перетворення одного мікромоля субстрату в 1 хвилину при заданих стандартних умовах – стандартна одиниця активності.

     За  рішенням Міжнародного біохімічного союзу активність вирішено визначати при t = 30^оС за початкової швидкості реакції, коли концентрація насичення ферменту і тимчасова залежність близька до кінетики реакції нульового порядку. Інші параметри реакції індивідуальні для кожного ферменту. Активність ферментного препарату виражається в мікромолях субстрату, прореагувавшого під дією 1 мл ферментного розчину або 1 грама препарату в оптимальних умовах за 1 хвилину. Якщо ферментний препарат не містить баласту, то його активність виражається в тих же стандартних одиницях на 1 мг ферменту. Якщо ж є баласт, то активність вважається на 1 мг білка в ферментному препараті. Активність випускаємого препарату – найважливіший нормований показник якості.

     Основну частину ферментів, одержуваних  промисловим способом, складають  гідролази. До них відносяться, в першу чергу амилолітичні ферменти: α-амілаза, β-амілаза, глюкоамілаза. Їх основна функція - гідроліз крохмалю і глікогену. Крохмаль при гідролізі розщеплюється на декстрини, а потім до глюкози. Ці ферменти застосовуються у спиртовій промисловості, хлібопеченні.

     Протеолітичні ферменти утворюють клас пептидгідролаз. Їхня дія полягає у прискоренні гідролізу пептидних зв'язків у білках і пептидах. Важлива їхня особливість - селективний характер дії на пептидні зв'язки в білковій молекулі. Наприклад, пепсин діє тільки на зв'язок з ароматичними амінокислотами, трипсин – на зв'язок між аргініном і лізином. У промисловості протеолітичні ферменти класифікують за здатністю проявляти активність у певній галузі рН:

• рН 1.5 - 3.7 - кислі протеази;
• рН 6.5 - 7.5 - протеази;
• pH > 8.0 - лужні протеази.

     Протеази находять широке застосування в різних галузях промисловості:

• м’ясна – для пом’якшення м’яса;
• шкіряна – пом'якшення шкір;
• кіновиробництво – розчинення желатинового шару при регенерації плівок;
• парфумерна – добавки в зубну пасту, креми, лосьйони;
• виробництво миючих засобів – добавки для видалення забруднень білкової природи;
• медицина – при лікуванні запалювальних процесів, тромбозов;

     Пектолітичні ферменти зменшують молекулярну масу і знижують в'язкість пектинових речовин. Пектинази діляться на дві групи - гідролази і транселімінази. Гідролази відщеплюють метильні залишки або розривають глікозидні зв'язки. Транселімінази прискорюють негідролітичні розщеплення пектинових речовин з утворенням подвійних зв'язків. Застосовуються в текстильній промисловості (вимочування льону перед переробкою), у виноробстві – освітлення вин, а також при консервуванні фруктових соків.

     Целюлолітичні ферменти дуже специфічні, їх дія виявляється в деполімеризації молекул целюлози. Зазвичай використовуються у вигляді комплексу, який доводить гідроліз целюлози до глюкози (у гідролізній промисловості). У медичній промисловості їх використовують для виділення стероїдів з рослин, у харчовій – для поліпшення якості рослинних олій, у сільському господарстві – як добавки до комбікормів для жуйних тварин.

     Існує ряд факторів, що впливають на біосинтез ферментів. У першу чергу, до них відноситься генетичний. Склад і кількість синтезованих ферментів спадково детерміновані. Застосовуючи мутагени можна змінити генетичні властивості мікроорганізмів і отримати штами з цінними для промисловості властивостями. До мутагенних факторів належать іонізуючі та неіонізуючі випромінювання, ізотопи, антибіотики, інші хімічні сполуки, що перетворюють спадкові елементи клітини. Незважаючи на визначальну роль генетичного фактора у біосинтезі ферментів, продуктивність біотехнологічних процесів залежить і від складу живильного середовища. При цьому важливо не тільки наявність джерел основних поживних речовин, але і речовин, що грають роль індукторів або репресорів біосинтезу даного конкретного ферменту або їх груп. Механізм цього явища ще не цілком вивчений, але сам факт має враховуватися при виборі технології.