В последнее время пристальное  внимание уделяется упрощению процедуры  получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида.

     Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды соединяются по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе. 
 
 
 
 
 
 

     Получение интерферонов. 

     Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой от 15000 до 21000 дальтон, продуцируемые и секретируемые  клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие возбудители.

     Интерфероны (ИФН) — группа аутогенных гликопротеинов, биомеханизм действия которых связан с одновременным противовирусным  эффектом - активацией клеточных генов, в результате чего синтезируются  белки, ингибирующие синтез вирусной ДНК (РНК) и обладающие иммуномодулирующим эффектом — способностью усиливать  экспрессию антигенов на клеточных  мембранах и увеличивать активность цитотоксических Т-клеток и естественных киллеров [4].

     ИФН подразделяются на два типа. К первому  типу, действующему как ингибиторы репликации вируса и оказывающему преимущественно  противовирусный эффект, относятся 22 различных подтипа ИФН-α и  один подтип ИФН-β. Ко второму типу, проявляющему иммуномодуляторную активность, относятся ИФН-γ.

     Существует  три иммунологически различных  класса ИФН: ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ.

     К ИФН естественного происхождения  относятся лимфобластоидный и лейкоцитарный  ИФН (ИФН-α), синтезируемые соответственно стимулированными моноцитами и В-лимфоцитами  человека, которые затем экстрагируются и очищаются; фибробластный ИФН (ИФН-β), получаемый из культуры фибробластов человека, и Т-лимфоцитарный ИФН (ИФН-γ).

     К искусственно синтезируемым ИФН  относится рекомбинантный ИФН-α, который  представляет собой высокоочищенный  единственный подтип ИФН-α, получаемый по рекомбинантной молекулярной технологии. 

     Особенности получения интерферонов. Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами.

     Основным  недостатком этих способов получения  интерферонов являются вероятность  контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов  В и С, вируса иммунодефицита и  др.

     В настоящее время более перспективным  признан способ получения интерферона  микробиологическим синтезом, который  обеспечивает возможность получения  целевого продукта со значительно более  высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать  оптимальные для бактериальной  экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

     В качестве исходных микроорганизмов  используют различные конструкции  штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

     Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные  условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.

     Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации  при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.

     Известно  большое количество плазмид и  созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм  Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая  химия, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком  технологий, основанных на использовании  этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень  экспрессии интерферона.

     Наряду  с особенностями используемых штаммов  эффективность процесса во многом зависит  от используемой технологии выделения  и очистки интерферона.

     Известен  способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку  полиэтиленимином, фракционирование сернокислым  аммонием, гидрофобную хроматографию  на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного  элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.

     Известен  также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование  штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в  колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку  ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида  в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный  сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041).

     Недостатками  этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится  к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности  использования этого метода для  промышленного производства интерферона.

     В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения  лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании  рекомбинантного штамма E.coli, замораживании  полученной биомассы при температуре  не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат  ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой  формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении  осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.

     Экспрессия  интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя  промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии.

     Недостатком способа является низкая технологичность  использования ферментативного  разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает  нестабильность процесса выделения  интерферона, приводит к снижению его  качества и ограничивает возможность  использования приведенной схемы  для промышленного производства интерферона.

     Недостатками  данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора  фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором  ген Т7 РНК полимеразы находится  под промотором lac оперона и который  всегда "течет". Следовательно, в  клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации  плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона.

     Для получения больших количеств  ИФН используют шестидневные однослойные  культуры клеток куриного эмбриона или  культивируемые лейкоциты крови  человека, зараженные определенным видом  вируса. Иными словами, для получения  ИФН создают определенную систему  вирус-клетка.

     Из  клетки человека изолирован ген, ответственный  за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения  кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

     1) Из лейкоцитов человека выделяют  мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной  плазмиды.

     2) Полученным продуктом трансформируют  Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют  на группы, которые идентифицируют.

     3) Каждую группу клонов гибридизируют  с ИФН - мРНК.

     4) Из образовавшихся гибридов, содержащих  кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят  ее трансляцию в системе синтеза  белка [4].

     5) Определяют интерферонную противовирусную  активность каждой смеси, полученной  в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся  с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют  клон, содержащий полноразмерную  ИФН - кДНК человека.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Заключение 

     Следую  вышеизложенному, можно сделать вывод, что спектр функций высокоактивных полипептидов в организме человека весьма обширен. Это:

     - Регуляторная 

     - Защитная

     - Сигнальная

     И в настоящее время все чаще появляются высокотехнологичные способы  синтеза препаратов методами биотехнологии, в частности генной инженерии.

     Данные  методы позволяют сэкономить значительное количество средств в отличии от традиционных методов получения.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Список  использованных источников

1. Биотехнология: Принципы и применение / под редакцией  И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джойса; пер. с англ.- М.: Мир, 1998, стр.45-82.
2. Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗов В 8 кн. /Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова.- М.: Высшая школа, 1987.
3. Кефели В.И., Дмитриева Г.А. Биотехнология: курс лекций. Пущино, 1989. 96 с.
4. Молекулярная биология. Структура и функции белков./ Степанов В. М.// Москва, Высшая школа, 1996.
5. Николаев В. Биотехнология – приоритетное направление // Фармацевтический вестник. http://www.pharmvestnik.ru/cgi-bin/statya.pl?sid=3782.
6. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. – Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.
7. Производство белковых веществ. Биотехнология. Кн. 5 : учеб. пособие для вузов / [В.А.Быков и др.]. – М.: Высш. шк. – 1987. – 142 с.
8. Сазыкин Ю. О. Биотехнология: учебное пособие для студентов высш. учеб. заведений / Ю.О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И.И. Чакалева; под ред. А.В. Катлинского. – 3-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2008.