В 80- годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать с помощью  E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.

     Использование аффинной хромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител.

     Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется  и независимо от формы препарата  имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

     Типы  препаратов инсулина. Препараты инсулина отличаются друг от друга по степени очистки; источнику получения (бычий, свиной, человеческий); веществам, добавляемым к раствору инсулина (удлиняющим его действие, бактериостатикам и т.д.); концентрации; величине рН; возможности смешивания ИКД с ИПД.

     Препараты инсулина различаются по источнику  получения. Инсулин свиньи и быка отличается от человеческого по аминокислотному составу: бычий - по трем аминокислотам, а свиной - по одной. Неудивительно, что при лечении бычьим инсулином побочные реакции развиваются гораздо чаще, чем при терапии свиным или человеческим инсулином. Эти реакции выражаются в иммунологической инсулинорезистентности, аллергии к инсулину, липодистрофиях (изменении подкожножировой клетчатки в месте инъекции).

     Несмотря  на явные недостатки бычьего инсулина, он все еще широко используется в  мире. И все же недостатки бычьего  инсулина в иммунологическом плане  очевидны: его ни в коем случае не рекомендуется назначать больным впервые выявленным сахарным диабетом, беременным или для кратковременной инсулинотерапии, например в периоперационном периоде. Отрицательные качества бычьего инсулина сохраняются и при использовании его в смеси со свиным, поэтому смешанные (свиной+бычий) инсулины также не стоит использовать для терапии указанных категорий больных.

     Препараты инсулина человека по химической структуре  полностью идентичны человеческому  инсулину.

     Основной  проблемой биосинтетическиго метода получения инсулина человека является полная очистка конечного продукта от малейших примесей использованных микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности. Новые методы контроля качества гарантируют, что биосинтетические инсулины человека вышеперечисленных производителей свободны от каких-либо вредных примесей; таким образом, их степень очистки и сахароснижающая эффективность отвечают самым высоким требованиям и являются практически одинаковыми. Каких-либо нежелательных побочных действий, зависящих от примесей, эти препараты инсулина не имеют.

     В настоящее время в медицинской  практике используют инсулины трех типов:

     - короткодействующие с быстрым началом эффекта;

     - средней продолжительности действия;

     - длительного действия с медленным  проявлением эффекта. 

     Инсулин короткого действия (ИКД)– регулярный инсулин – представляет собой  короткодействующий растворимый при  нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в течение 15 минут после подкожного введения и продолжается 5-7 часов.

     Первый  инсулин продленного действия (ИПД) был создан в конце 30-х гг., чтобы  больные смогли делать инъекции реже, чем это было при использовании  только ИКД, - по возможности один раз  в сутки. С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении  в нейтральной среде образуют суспензию. Они содержат протамин в  фосфатном буфере – протамин-цинк-инсулин  и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) – НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере – инсулины ультраленте, ленте, семиленте.

     Препараты инсулина средней продолжительности  действия содержат протамин, представляющий белок средней м.м. 4400, богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1:10. после подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, позволяя инсулину всасываться.

     НПХ-инсулин не изменяет фармакокинетический профиль смешиваемого с ним регуляторного инсулина. НПХ-инсулин предпочтительнее инсулина ленте в качестве компонента средней длительности действия в терапевтических смесях, содержащих регулярный инсулин.

     В фосфатном буфере все инсулины легко  образуют кристаллы с цинком, но только кристаллы бычьего инсулина обладают достаточной гидрофобностью, чтобы обеспечить замедленное и  стабильное высвобождение инсулина, характерного для ультраленте. Цинковые кристаллы свиного инсулина растворяются быстрее, эффект наступает раньше, длительность действия короче. Поэтому не существует препарата ультраленте, содержащего только свиной инсулин. Монокомпонентный свиной инсулин выпускают под названием инсулин-суспензия, инсулин-нейтрал, инсулин-изофан, инсулин-аминохинурид.

     Инсулин ленте – это смесь 30% инсулина семиленте (аморфный преципитат инсулина с ионами цинка в ацетатном буфере, эффект которого развеивается относительно быстро) с 70% инсулина ультраленте (плохо растворимый кристаллический цинк-инсулин, имеющий замедленное начало и пролонгированное действие). Эти два компонента обеспечивают комбинацию с относительно быстрой абсорбцией и стабильным длительным действием, делая инсулин-ленте удобным терапевтическим средством.

     Технология  получения инсулина. Инсулин человека можно производить четырьмя способами:

     1) полным химическим синтезом;

     2) экстракцией из поджелудочных  желез человека (оба этих способа  не подходят из-за неэкономичности:  недостаточной разработанности  первого способа и недостатка  сырья для массового производства  вторым способом);

     3) полусинтетическим методом с  помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;

     4) биосинтетическим способом по  генноинженерной технологии. Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.

     В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.

     Инсулин оказался первым белком, полученным для  коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

     В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение  обеих цепей с последующим  фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

     Во  втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

     При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

     - белок носитель, обеспечивающий  транспортировку гибридного белка  в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

     - аффинный компонент, существенно  облегчающий выделение гибридного  белка.

     При этом оба эти компонента могут  одновременно присутствовать в составе  гибридного белка. Кроме этого, при  создании гибридных белков может  использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.

     В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.

     Химическим  способом получают ген, программирующий  биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие  в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина.

     Следующий этап – включение гена предшественника  инсулина (или гены цепей порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия.

     Из  E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

     Природа гормонального вещества, продуцируемого E.coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препитида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин.

     Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок  подвергают химко-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фпрнтальной, гельпроникающей, анионообменной).

     В Институте РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitroосуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

     Можно использовать штамм со встроенной в  плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.

     Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.

     Возможен  и другой путь: получается в бактериальной  системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.

     Выделенный  белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.