Aspergillus terreus — продуцент ітаконової кислоти

2.2. Розділ 2 «Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів» 

     Завдання 1. Назвіть тип живлення, якщо джерелом енергії є світло, а джерелом вуглецю і донором електронів – ацетат.

     Розв’язання

   У класифікації типів живлення у мікроорганізмів  використовується термінологія, запропонована  у 1946 р. на симпозіумі в Колд Спринг Харбор. Розглядаються такі типи живлення (трофії):

1. щодо джерела енергії (хемо – хімічне, фото – світлове);
2. щодо донора електронів (органо – органічна речовина, літо – неорганічна). Такими неорганічними донорами електронів є Н₂, NH₃, H₂S, CO, Fe²⁺ та ін.
3. щодо джерела вуглецю (авто – вуглекислота, гетеро – органічна сполука).

Комбінації  всіх цих термінів дають можливість описати більшість типів живлення (табл. 1.).

Таблиця 1.

Характеристика  типів живлення у  бактерій

• щодо джерела енергії (світло) —  фототрофія;
• щодо донора електронів (ацетат – органічна сполука) —  органотрофія;
• щодо джерела вуглецю (ацетат – органічна сполука)  – гетеротрофія.

     Відповідно, тип живлення визначають як фотоорганогетертрофію. 

Завдання 2. Чи правильно вказаний склад поживного середовища (г/л)? Якщо так, для вирощування яких мікроорганізмів це середовище може бути використане?

Цитрат  натрію - 20;

KCL - 2,5;

NH₄CL – 1,5;

MgSO₄х7Н₂0 - 0,2;

CaCl₂х2Н₂0 - 0,1;

FeSO₄x7H₂0 - 0,001. 

Розв’язання

     Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, мають відповідати таким мінімальним вимогам: у них мають бути присутні всі елементи, з яких будується клітина, при чому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати.

     До  складу бактеріальної клітини входять  такі елементи, % до маси сухої речовини:

Карбон — 50;

Оксиген — 20;

Нітроген — 10 -14;

Гідроген — 8;

Фосфор — 3;

Сульфур, Калій, Натрій — 1;

Кальцій, Магній, Хлор — 0,5;

Ферум — 0,2;

решта елементів  — близько 0,3.

Таблиця 2.

Десять  головних біоелементів,їх джерела і деякі  функції

 

     Тільки  невелика кількість елементів періодичної  системи потрібна мікроорганізмам  у відносно високих концентраціях (>10^-4 M). Це десять головних біологічних елементів: вуглець, кисень, водень, азот, сірка, фосфор, калій, магній, кальцій та залізо (див. табл2) . Крім десяти головних біоелементів, мікроорганізмам необхідні мінорні біоелементи, котрі представлені в табл. 3, джерелом яких, як правило, є водопровідна вода.

Таблиця 3.

Мінорні  біоелементи, їх джерела  та функції в клітині

     У середовищі наведеного складу цитрат натрію може бути джерелом вуглецю, кисню та водню; хлорид амонію (NH₄CL) є головним джерелом азоту; хлорид калію (KCL) –калію, сульфат магнію (MgSO₄х7Н₂0) — магнію та сірки; хлорид кальцію (CaCl₂х2Н₂0) – кальцію; сульфат феруму (FeS0₄x7H₂0) – джерелом заліза та сірки. З десяти головних біоелементів у даному поживному середовищі присутні всі, окрім фосфору. Останній є компонентом нуклеїнових кислот, фосфоліпідів та нуклеотидів. Отже, поживне середовище наведеного складу непридатне для вирощування мікроорганізмів

Завдання 3. Концентрація хлориду амонію в середовищі для вирощування бактерій становить 1,5 г/л, а глюкози – 0,1М. Розрахуйте теоретично можливий рівень біомаси

     Розв’язання

     В даній задачі хлорид амонію виступає головним джерелом азоту, а глюкоза – вуглецю. Вміст вуглецю в складі бактеріальної клітини  –  50% від сухої маси речовин. Вміст азоту в складі бактеріальної клітини становить 10 – 14% від сухої маси речовин.

     Для визначення рівня біомаси, якого можна досягнути при культивуванні бактерій на середовищі з 1,5 г/л нітрату амонію і 0,1×180=18 г/л глюкози, потрібно спочатку розрахувати вміст елементного азоту в складі хлориду та елементарного вуглецю в глюкозі.

          Мr(NH₄Cl)=53,5 г/моль, отже, на 53,5 г NH₄Cl припадає 14 г N; на 1,5 г NH₄Cl – х г N. Отже, х = (1,5×14)/ 53,5=0,4 г (N);

     Відповідно, якщо в біомасі 10% азоту, то з 0,4 г азоту можна одержати 4,0 г /л біомаси.

     М(С₆Н₁₂О₆) = 180г/моль, отже, на 180 г глюкози припадає 72 г С; а на 18 г глюкози– х г С. Отже, х = (18×72)/180 = 7,2 г C.

     Оскільки  у процесі росту мікроорганізмів  на глюкозі в аеробних умовах близько 50% глюкози окиснюється до СО₂ для одержання енергії, то лише половина вмісту вуглецю – 3,6 г перетворюється на клітинний матеріал. Отже, якщо в біомасі 50% вуглецю, то з 18 г глюкози може насинтезуватися 7,2 г клітинного матеріалу.

     Хлорид амонію виступає лімітуючим  фактором.

Можливий рівень біомаси – 4,0 г/л. 
 

    Поживні середовища, особливості біосинтезу Aspergillus terreus .

    Промислове  виробництво ітаконової кислоти базується на використанні А. terreus. Субстратом зазвичай є меляса, розбавлена водою до 8 % (за вмістом вуглеводів). У середовище також додають, г/л: магнію сульфат — 4.5, амонію нітрат — 2.5, цинку сульфат — 0.0044, кукурудзяний екстракт - 4 мл, жовту кров'яну сіль — 0.25. Таке середовище або подібні до нього інші 
варіанти середовищ використовують для поверхневого і глибинного (в останньому разі знижують концентрацію вуглеводів до 1—2 %) культивування продуцента. Оптимальний рівень рН середовища для біосинтезу ітаконової кислоти становить 1,8—2,3. Тривалість культивування в кюветах зазвичай становить 10—12 днів при 35 °С; у разі глибинного культивування тривалісті процесу скорочується до 2—3 діб з аерацією 1/8 об'ємів повітря на 1 хв на один об'єм середовища. [6]

 

2.3. Розділ 3 «Енергетичний баланс окиснення субстрату»

      Завдання. Скласти енергетичний баланс окислення глюкози за наступних умов: :

1. катаболізм глюкози здійснюється за гліколітичним шляхом;

б) Р/О = 3;

в) ізоцитратдегідрогеназа і малатдегідрогеназа є НАДФ⁺-залежними ферментами. 

     Аналіз  окисно-відновних потенціалів (табл. 4) показує, що у дихальному ланцюгові є тільки три етапи окиснення, на яких вивільнюється стільки енергії, скільки міститься в одному макроергічному зв'язку. При перенесенні двох протонів від НАДН на кисень тільки три електронні переходи можуть бути спряжені з фосфорилюванням АДФ у АТФ. Такий зв'язок окиснення та фосфорилювання виражають у вигляді коефіцієнта Р/О.

     Таблиця 4.

Окисно-відновні потенціали компонентів  дихального ланцюга, різниця потенціалів та еквівалентні зміни вільної енергії 

 
 
 
 

     Р/О  — це число молекул АТФ, утворюваних  у розрахунку на один атом кисню. У мітохондріальному дихальному ланцюгові цей коефіцієнт дорівнює трьом, якщо донор електронів є НАДН, і двом, якщо донор електронів ФАД. Відомі навіть пункти утворення АТФ, що видно з  таблиці: дегідрування НАДН, окиснення цитохрому b та окислення цитохрому а. Знаючи співвідношення Р/О, можна скласти енергетичний баланс окиснення субстрату.