Применение молекулярных маркеров в селекции пшеницы

Таблица 3. Опубликованные маркеры к хозяйственно важным генам  пшеницы 

Признак	Локус	Источник	Маркер	хромосома
Устойчивость  к болезням
Листовая ржавчина	Lr1	Triticum aestivum	RFLP/STS	5DL
	Lr3	T. aestivum	RFLP	6BL
	Lr9	Aegilops	RAPD/STS	6BL
		umbellulata	RFLP
	Lr10	T. aestivum	RFLP/STS	1 AS
	Lr13	T. aestivum	RFLP	2 BS
	Lr18	T. timopheevii	N-band	5BL
	Lr19	Thinopyrum	RFLP	7DL
			Isozyme
	Lr20	T. aestivum	RFLP	5 AL
	Lr23	T. turgidum	RFLP	2BS
	Lr24	Agropyron	RFLP	3DL
		elongatum	RAPD/STS
			RAPD/SCAR
	Lr25	Secale cereale	RAPD	4BL
	Lr27	T. aestivum	RFLP	3BS
	Lr29	Ag. elongatum	RAPD	7DS
	Lr31	-	RFLP	4BL
	Lr32	Ae. tauschii	RFLP	3DS
	Lr34	T. aestivum	RFLP	7DS
	QTL	T. aestivum	RAPD/RFLP	7BL, 1BS, 1DS
Подавитель	SuLr23	-	RFLP	2DS
Стеблевая ржавчина	Sr2	T. turgidum	RFLP/STS	3BS
	Sr5	T. aestivum	RFLP	6DS
	Sr9e	T. aestivum	RFLP	2BL
	Sr22	T. monococcum	RFLP	7AL
	Sr36	T. timopheevii	RFLP	2BS
Желтая ржавчина	Yr15	T. dicoccoides	RFLP/RAPD	1BS
Настоящая мучнистая роса	Pm1	-	RFLP	7AS
			RFLP
			RAPD-STS
	Pm2	-	RFLP	5D
			RFLP, STS
	Pm3	-	RFLP	1A
			RFLP
	Pm4a	-	RAPD	.
	Pm4b	-	AFLP	-
	Pm12	Ae. speltoides	RFLP	6B/6S
	Pm18	-	RFLP	7AL
	Pm21	Haynaldia villosa	RAPD	6VS, 6AL
	Pm25	T. monococcum	RAPD	1A
Подавитель	SuPm8	-	Storage protein	1AS
Вирус полосатой мозаики  пшеницы	Wsm1	Ag. elongatum	STS	-
Твердая головня	Bt-10	-	RAPD
Пыльная головня	Ut-X (T10)	-	RFLP/RAPD-	-
			STS
	T19	-	Antibody	6A
Глазковая пятнистость	Pch1	-	RFLP/lsozyme	7DL
	Pch2	T. aestivum	RFLP	7AL
Пиренофороз	QTL	-	RFLP	1AS, 4AL, 2DL
Фузариоз колоса	QTL	T. aestivum	AFLP/RFLP	3BS, 2AL, 6BS, 4BL
Индийская головня	QTL	T. turgidum	RFLP	3BS, 5AL
Устойчивость  к вредителям
Гессенская муха	H3,5,6,9,	-	RAPD	1A, 5A
	10, 11, 12,
	13, 14, 16, 17
	H9	-	RAPD	-
	H21	S. cereale	RAPD	2RL
	H23, H24	Ae. tauschii	RFLP	6D, 3DL
	H27	Ae. ventricosa	Isozyme	4M
Овсяная цистообразующая нематода	Cre1	T. aestivum	RFLP-STS	2BL
	Cre2	-	RFLP	6BL
	Cre3	Ae. tauschii	RAPD	2DL
	(Ccn-D1)
Устойчивость  к абиотическим стрессам
Поглощение кадмия	-	-	RAPD	-
Aluminium tolerance	Alt2	-	RFLP	4D, 4DL
Засуха	-	-	RFLP	5A
Соотношеине Na+/K+	Kna1	T. aestivum	RFLP	4D, 4DL
Качество продукции
Твердозерность	Ha		RFLP	5D
	Hn, QTL	.	RFLP	5DS, 2A, 2D,
				5B, 6D
Содержание белка в  зерне	QTL	T. turgidum	RFLP	4BS, 5AL, 6AS,
				6BS, 7BS
Высокое содержание белка	-	T. dicoccoides	ASA	6B
НМВ глютенин	-	T. turgidum	-	1B
ВМВ глютенин	Glu-D1-1	T. aestivum	ASA	1DL
Цвет муки	-	-	RFLP/AFLP	7A
Другие признаки
Прорастание на корню	QTL	T. aestivum	RFLP	-
Яровизация	Vrn1	.	RFLP	5AS
	Vrn3	-	RFLP	5DS
Фотопериодизм	Ppd1	T. aestivum	RFLP	2DS
	Ppd2	T. aestivum	RFLP	2BS
Карликовость	Rht8	-	SSR	2DS
	Rht 12	-	SSR	5AL
Востановление фертильности	Rf1, Rf3	-	RFLP	6BS, 1BS
Мейотическое спаривание	ph1b	-	RFLP/STS	5BL, 5BL
	Deletion	-	AFLP/STS

Картирование  генов количественных признаков

Малое число количественных признаков, распределенных в соответствующие  им ЛКП на пшенице, является отражением ориентации на просто наследуемые признаки и сложности построения исчерпывающих  генетических карт.

Найден ЛКП прорастания зерна на корню в результате исследования с использованием около 40 RFLP-маркеров на 2 расщепляющихся популяциях рекомбинантных инбредных линий (RIL), которые оценивались по признаку прорастания на корню в 7 различных средах.(8) Используя комбинацию RFLP-маркеров на большей части популяции RIL и селективное генотипирование с AFLP части популяции, идентифицированы 5 предполагаемых ЛКП устойчивости к фузариозу колоса (табл.3)/

В CIMMYT усилия в выведении устойчивости к болезням в целом и к листовой ржавчине в частности сосредоточились на использовании жесткой устойчивости. Такая устойчивость контролируется рядом минорных генов, которые также называются APR (adult plant resistance). Чтобы определить локализацию и число этих генов и найти тесно сцепленные с ними маркеры, в CIMMYT вовлекли в картирование APR-локусы в устойчивых к листовой ржавчине сортах Parula и Frontana. Используя BSA  на наборе RIL от скрещивания между сортами Parula и Siete Cerros, идентифицированы 3 RAPD-маркера, связанных с 2 локусами устойчивости к листовой ржавчине. Нулли-тетрасомный анализ показал, что они локализованы на длинном плече хромосомы 7B и коротком плече хромосомы 1B или 1D. В СIMMYT также составили генетическую карту сцепления с использованием RFLP, SSR и AFLP-маркеров в расщепляющейся популяции, полученной от скрещивания Frontana x INIA66, чтобы картировать прежде всего жесткую устойчивость к листовой ржавчине, но также и другие важные признаки, которые расщеплялись в данной популяции. Хотя карта сейчас включает ок.450 маркерных локусов, некоторые пробелы до сих пор существуют, и усилия сосредотачиваются на их заполнении с использованием SSR-маркеров. С использованием данной карты и метода комбинированного интервального картирования, CIMMYT идентифицировал 5 и 7 ЛКП устойчивости к листовой ржавчине и вирусу желтой карликовости ячменя, соответственно.(7)

 

 

 

 

 

Селекция с  использованием молекулярных маркеров

Для эффективного применения молекулярных маркеров в селекции требуется 3 фактора:

1. доступность дешевых,  простых в использовании и  надежных маркеров

2. подтверждение маркеров  на различном генетическом фоне

3. возможность их использования  в селекционной программе 

RFLP, RAPD и AFLP не удовлетворяют 1-му требованию. Однако имеются техники, чтобы конвертировать их в более «дружественные» маркеры. Клоны RFLP могут быть секвенированы, и созданы праймеры для амплификации ДНК-фрагментов, для которых с помощью гибридизации показана их полиморфность. Однако получаемые таким образом STS или SCAR-маркеры не всегда являются полиморфными, и в этом случае требуются дальнейшие манипуляции. Амплифицированный фрагмент обычно расщепляется 1 или 2 рестриктазами для того, чтобы выявить небольшие различия по длине, или фрагмент из 2 или более сортов клонируется и секвенируется снова для создания ASA-маркеров, с помощью которых можно обнаружить различия всего по 1 нуклеотиду. RAPD- и AFLP-фрагменты могут быть выделены из геля, клонированы и секвенированы для создания STS или SCAR, и, если нужно, ASA. Подходы для создания таких маркеров для пшеницы не всегда являются успешными и легко достижимыми. Однако, если они есть, они представляют собой очень надежные маркеры. С другой стороны, если SSR тесно связаны с генами интереса, то они, вероятно, являются наиболее привлекательными маркерами, т.к. для их применения не требуется дальнейших манипуляций.

Несмотря на то, что в таблице 3 представлено большое количество маркеров для генов пшеницы, лишь некоторые из этих маркеров являются достаточно тесно связанными с генами интереса, чтобы быть полезными в селекции. Некоторые из этих были протестированы на с использованием ряда сортов пшеницы, напр., Lr1, Pm1 и Pm2, Bt-10, гены устойчивости к гессенской мухе, Cre1 и Cre3. Хотя, в общем, исследовано недостаточное число сортов, некоторые маркеры, по всей видимости, являются надежными, например маркеры к генам Lr9,Lr10 и Lr19.(4)

Другим фактором, хотя и  влияющим в меньшей степени на успешность использования ДНК-маркеров в селекции, является недостаток маркеров, используемых непосредственно в селекционных программах. Часто ученые, подбирающие маркеры, не связаны напрямую с селекционными программами и/или их лаборатории не в состоянии поддерживать достаточно значительные объемы растительного материала, требуемые для осуществления селекционных программ.

На сегодняшний день ДНК-маркеры  в селекции пшеницы используются довольно ограниченно. Примерами их использования могут служить ASA или SCAR-маркеры к признакам поглощения кадмия, высокого содержания белка и транслокации 1В/1R. Сообщается об очень надежных маркерах для генов Cre1 и Cre3 и о возможности использовать их для внедрения 2 аллелей устойчивости в австралийские сорта пшеницы.

CIMMYT в настоящее время занимается проверкой ряда маркеров к генам интереса (напр., Ph1, Sr2, Lr1, 9, 10, 24 и HP) на имеющейся зародышевой плазме и созданием оборудования для простого и надежного использования маркеров в селекционных программах. При этом оборудование создается только для использования маркеров, основанных на ПЦР, и будет включать ДНК-секвенаторы и автоматические пипетирующие станции, чтобы иметь возможность обрабатывать большое число образцов в селекционных программах.(7)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Создание популяций  для маркерной селекции на пшенице

На сегодняшний день технология использования молекулярных маркеров усовершенствована настолько, что  основным практическим ограничением для  применения ее в селекции растений является поддержание популяции, достаточно большой для идентификации целевых  рекомбинантов. Сейчас обычным явлением являются селекционные программы пшеницы, в которых селекционная популяция анализируется по 10-12 несвязанным друг с другом локусам. Кроме маркерных локусов, популяции должны быть достаточно большими для сохранения достаточной вариабельности по многим признакам, для которых нет маркеров и селекция на которые должна производиться с использованием традиционных фенотипических оценок.(3)

Независимо от улучшений  в маркерной технологии, требуется  критический минимальный уровень  популяции для обеспечения с  высокой степенью доверия присутствия  целевого генотипа в селекционной популяции. Этот минимальный размер популяции  изменяется в зависимости от следующих  параметров:

- числа объединяемых локусов

- частоты встречаемости  альтернативных аллелей в данных  локусах

- степени генетической  сцепленности маркера с целевым геном

- характера наследования  маркера (доминантный или кодоминантный)

- уровня гомозиготности и сцепления между целевыми аллелями

Знание минимального размера  популяции позволяет осуществить  эффективное распределение ресурсов путем гарантии того, что размеры  популяции достаточно велики для  высокой вероятности успешной работы, но не требуют больше ресурсов, чем  необходимо. Понимание эффектов инбридинга, типа популяции (бипарентальная популяция, популяция беккроссов), частоты аллелей и точность определения минимального размера популяции очень важны для осуществления экономически эффективных стратегий скрещивания и селекции.

Стратегии, которые увеличивают  частоту целевых генотипов, должны увеличивать эффективность маркерной  селекции, позволяя использовать популяции  меньшего размера или селекцию по большему числу локусов. Одним из наиболее употребимых путей увеличения частоты целевых генотипов является «обогащение» целевыми аллелями популяции F2 (F2-обогащение) путем отбора носителей (или негативного отбора гомозигот, которые не несут целевых аллелей), беккроссирования для увеличения частоты рекуррентных родительских аллелей, и инбридинга (или получения дигаплоидных популяций) для увеличения частоты гомозигот в популяции, являются эффективными стратегиями достижения этих целей. Характер наследования маркера (доминантный или кодоминантный) не изменяет размер популяции, требуемой для обеспечения присутствия целевого генотипа, но влияет на количество тестов, требуемых для идентификации экземпляра растения, несущего этот генотип.

Наиболее эффективной  стратегией уменьшения размера популяции, требуемой для получения гомозиготы по целевым локусам, является F2-обогащение с последующим отбором гомозигот в более поздних поколениях или в популяциях дигаплоидов. F2-обогащение производится в 2 этапа. На 1-м этапе происходит собственно обогащение, когда из популяции F2 отбираются  особи, несущие целевые аллели как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии. После этого на 2-м этапе происходит создание более или менее гомозиготных линий на основании отобранных в F2 растений. F2-обогащение эффективно потому, что оно существенно увеличивает частоту встречаемости аллелей, но требует для скрининга относительно небольшую популяцию F2. Например, в бипарентальной F2-популяции, где каждый полиморфный аллель имеет ожидаемую частоту 0,5, ожидаемая частота носителей данного целевого аллеля составляет 0,75, а для n локусов – 0,75ⁿ. Частота встречаемости гомозигот намного ниже – 0,25ⁿ. После обогащения частоты отбираемых аллелей возрастают в среднем до уровня 0,67, что ведет к существенному увеличению частоты целевых гомозигот в поздних поколениях или популяциях дигаплоидов, полученных из F2. Если отбор планируется производить по 6 локусам, для обогащения требуется только 16 индивидуальных образцов F2, в то время как для идентификации индивидуальных гомозигот по 6 целевым аллелям требуется 12270 образцов. После обогащения для получения гомозиготы с 6 целевыми локусами требуется популяция F2:3 всего из 191 растения, по сравнению с 1076 растениями в популяции F2:3, которая не подвергалась обогащению. Сокращение размера популяции в результате обогащения растет пропорционально увеличению числа локусов. В результате F2-обогащения достигается также значительное снижение размера популяций топкроссов и беккроссов. (3)

Инбридинг эффективен для  снижения размера популяции благодаря  снижению уровня гетерозиготности в популяции в 2 раза каждый год. В бипарентальной популяции инбридинг от F2 к F2:3 снижает частоту гетерозигот по каждому полиморфному локусу с 0,5 до 0,25. В популяции, в которой производится отбор по 3 локусам, инбридинг от F2 к F2:3 снижает размер популяции, требуемой для создания гомозиготы по этим 3 аллелям, со 191 до 56 растений. В дальнейших циклах инбридинга достигается все менее значительное уменьшение размера популяции с каждым шагом. Сокращение численности популяции в результате инбридинга дополняет сокращение от F2-обогащения и беккроссирования.(4)

Беккроссирование также снижает размер популяции по сравнению с бипарентальными скрещиваниями. Сокращение объясняется увеличением частоты аллелей рекуррентного родителя с 0,5 до 0,75. Сокращение размера популяции происходит всякий раз, когда один из родителей вносит в скрещивание больше целевых аллелей, чем другой. Преимущества беккроссирования дополняют F2-обогащение и инбридинг, хотя относительное преимущество, получаемое в результате беккроссирования, уменьшается в обогащенных популяциях, которые легче становятся инбредными. (4)

Характер наследования маркера  не влияет на размер популяции, требуемый  для получения целевого генотипа, но часто влияет на объем проверок, требуемых для идентификации  индивидуальных растений, несущих данный генотип. Если маркер доминантный, то требуется  проверка по потомству для идентификации  гомозигот в ранних поколениях, что ведет к увеличению количества проверяемого материала. Вероятность того, что индивидуальный образец, несущий доминантный маркер, гомозиготен по данному локусу, меняется в зависимости от аллельной частоты и уровня инбридинга. Если вероятность гомозиготности равна или выше принятого уровня (обычно 95%), то проверки по потомству не требуется. Если селекция ведется на несколько локусов, то вероятности для всех локусов перемножаются. С увеличением числа используемых доминантных маркеров требуется более высокий уровень инбридинга, чтобы избежать проверки по потомству. Многие недостатки доминантных маркеров преодолеваются, если получение более гомозиготной популяции привлекательно по другим причинам. Преимущества кодоминантных маркеров над доминантными для F2-обогащения состоит в том, что они выявляют действительную частоту аллелей и генотипов, что означает возможность уменьшения размеров последующих популяций, если частоты выше ожидаемых, и увеличения – если ниже. (5)

Селекция по фенотипическим  признакам должна использоваться в  сочетании с маркерной селекцией. Фенотипическая селекция обычно применяется  в поздних поколениях,  когда  наследуемость выше и больше количество семян. Размеры популяции должны быть достаточно большими для гарантии того, что желаемые фенотипически отбираемые аллели не утеряются в результате дрейфа генов раньше, чем можно будет применить оценку по фенотипу. Так как маркерная селекция аллелей применяется раньше, чем фенотипическая, то большее количество индивидуальных растений может быть отобрано с помощью маркеров.