Применение молекулярных маркеров в селекции пшеницы

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО  ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное образовательное  учреждение  высшего пРофессионального  образования российский государственный аграрный университет – МСха имени К.А. Тимирязева  (ФГОУ ВПО ргау - МСХА имени К.А. Тимирязева)

 

Кафедра генетики и биотехнологии

 

 

 

 

 

Курсовая работа по прикладной биотехнологии

«Применение молекулярных маркеров в селекции пшеницы»

 

 

 

 

Выполнил: студент 505 группы

агрономического факультета

Злобин И.Е.

                                       Проверил:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Москва, 2011

 

Содержание:

1. Общая характеристика молекулярных маркеров и особенности их использования в селекции пшеницы……………………………….3
2. Генетические карты пшеницы………………………………………6
3. Картирование единичных или главных генов………………..…….7
4. Картирование генов количественных признаков………………....10
5. Селекция с использованием молекулярных маркеров…………....12
6. Создание популяций для маркерной селекции на пшенице…..….14
7. Будущее молекулярной генетики пшеницы……………………….18
8. Список литературы ………………………………………………….20

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Общая характеристика молекулярных маркеров и особенности  их использования в селекции пшеницы

Молекулярная генетика, или  использование молекулярных техник для обнаружения различий в ДНК  разных растений, имеет множество  возможностей для применения в улучшении злаковых культур. Нередко удается установить различия в ДНК разных генотипов растений, которые ассоциированы со специфическими генами и являются «метками» этих генов. Такие различия называются молекулярными маркерами. Такие маркеры, когда они очень прочно связаны с генами интереса, могут быть использованы для отбора желаемого аллеля с целью ускорить беккроссирование данного аллеля или сосредоточить несколько аллелей в 1 генотипе. Маркеры также могут быть использованы для расчленения полигенных признаков на менделирующие компоненты или локусы количественных признаков, таким образом усиливая понимание наследования и действия генов данных признаков и позволяя использовать маркерную селекцию как дополнение к обычным селекционным методам.(1) Молекулярные маркеры также используются для оценки уровня генетической разнородности среди различных сортов, между популяциями, среди родственных видов и т.д. Применений для таких оценок множество, например фингерпринтинг сортов  для их идентификации и защиты, понимание взаимоотношений между различными изучаемыми объектами, эффективное управление генетическими ресурсами, облегчение интрогрессии хромосомных сегментов из других видов, и даже идентификация специфических генов. В дополнение, маркеры и сравнительное картирование различных видов являются очень ценными для улучшения понимания геномной структуры и функционирования и позволяют использовать изоляцию генов интереса с помощью генетических карт.(4)

Имеется несколько типов  молекулярных маркеров, каждый тип  имеет преимущества и недостатки. В таблице 1 приведены характеристики и использование наиболее распространенных маркерных систем. Первыми маркерами были RFLP-маркеры, которые широко и успешно использовались для создания карт сцепления у различных культур, в т.ч. у пшеницы. С развитием полимеразной цепной реакции был разработан ряд новых типов маркеров. Первыми из них были RAPD-маркеры, которые быстро превзошли RFLP по популярности благодаря большей простоте и меньшей стоимости анализа. Микросателлитные маркеры, или маркеры на основе простых повторов (SSR), соединяют преимущества RFLP (кодоминантность, надежность, специфическая геномная локализация) с простотой RAPD-маркеров и имеют преимущества в обнаружении высокого уровня полиморфизма. Маркеры на основе полиморфизма длин амплифицированных последовательностей (AFLP) имеют преимущество над маркерами, основанными на ПЦР, при работе с селективно амплифицированными фрагментами ДНК, предварительно расщепленной 1 или 2 рестриктазами. AFLP-маркеры способны выявить наибольший уровень полиморфизма за 1 реакцию.(1)

Таблица 1.  
Характеристика и использование различных типов молекулярных маркеров в молекулярной генетике и селекции пшеницы

Использование	RFLP	RAPD	SSR	AFLP
Фингерпринтинг сортов	++	-/+	+++	+++
Генетическая разнородность	++	-	++	+
Маркирование качественных признаков	++	++	++	+++
Картирование ЛКП	++	-/+	++	++
Селекция с помощью  маркеров	+	-	++	+/++
Сравнительное картирование	++	-	-	-
Принцип	Рестрикция эндонуклеазами; Саузерн-блоттинг, гибридизация	ДНК-амплификация со случайными праймерами	Амплификация простых  повторяющихся последовательностей  с использованием специфических  праймеров	Рестрикиця эндонуклеазами, использование адаптеров и специфических праймеров
Типы зондов/праймеров	Геномная ДНК, комплементарная ДНК	Случайные 9-или 10-членные  олигонуклеотиды	Специфичные 16-30-членные праймеры	Специфические адаптеры и селективные праймеры
Тип полиморфизма	Замены отдельных оснований; инсерции/делеции	Замены отдельных оснований; инсерции/делеции	Изменение длины повторов	Замены отдельных оснований; инсерции/делеции
Распространенность в  геноме	Высокая	Очень высокая	Средняя	Очень высокая
Уровень полиморфизма	Средний	Средний	Высокий	Высокий
Наследование	Кодоминантное	Доминантное	Кодоминантное	Доминантное
Число детектируемых локусов	3-9	1-10	1-3	70-140
Необходимость в информации о последовательности	Нет	Нет	Есть	Есть
Техническая трудность	Средняя	Низкая	Низкая	Средняя/высокая
Надежность	Высокая	Промежуточная	Высокая	Средняя/высокая
Требуемое количество ДНК	10-15 мкг	10-50 нг	50-100 нг	100-1 000 нг
Использование радиоизотопов	Требуется/не требуется	Не требуется	Требуется/не требуется	Требуется/не требуется
Стоимость разработки	Средняя	Низкая	Средняя	Высокая
Стоимость использования	Средняя	Низкая	Высокая	Средняя/высокая

 

Пшеница представляет собой  достаточно сложный объект для молекулярно-генетических исследований. Она является аллополиплоидом, содержащим 3 разных, но в целом родственных генома – А, В и D. Гаплоидный геном пшеницы содержит примерно 1,7*10¹⁰ н.п.; в среднем 1 хромосома содержит 810 млн.н.п. Средняя хромосома пшеницы в 25 раз длиннее, чем хромосома риса; таким образом, 3 хромосомы пшеницы по размеру эквивалентны гаплоидному геному кукурузы, а гаплоидный геном риса соответствует по размеру всего ½ хромосомы пшеницы. Такие большие размеры генома пшеницы являются результатом полиплоидии и обширных дупликаций, в результате чего ок.80% генома состоит из повторяющихся последовательностей ДНК, а уровень полиморфизма на пшенице значительно ниже, чем, например, на кукурузе. (7)

Таблица 2.

Характеристики генома мягкой пшеницы, обусловливающие трудности  в картировании по сравнению с  диплоидной кукурузой.

Вид		Пшеница	Кукуруза
Уровень плоидности		6x	2x
Число хромосом		21	10
Размер генома (число н.п.*106)		16 000	4 500
Уровень полиморфизма		Низкий	Высокий
	· RFLP: (%)	20-30	80-85
	· SSR: (%)	40-50	50-60
Повторяющиеся последовательности (%)		>80	60
Необходимо для создания генетической карты схожей плотности (15 маркеров на хромосому)
Требуемое число локусов		315	150
Требуемое число RFLP-зондов		1 000-1 500	200-250
Требуемое число пар SSR-праймеров		700-800	250-300

 

С другой стороны, пшеница  имеет и некоторые преимущества для использования молекулярных методов. Большая часть генов  пшеницы находится в геноме в  виде кластеров, а хромосомные регионы, окружающие данные кластеры, имеют  высокую частоту рекомбинации. Эти  регионы являются удобными для молекулярных манипуляций по сравнению с другими  злаковыми с небольшим геномом, такими как рис или сорго. Кроме  того, гексаплоидная природа пшеницы и удобство проведения с ней различных цитогенетических манипуляций предоставляют уникальные инструменты для молекулярно-генетических исследований. В их число входят использование различных анеуплоидов, таких как нуллитетрасомные и дителосомные линии, для определения молекулярных маркеров к специфическим плечам хромосом, линий с делециями хромосом для физического картирования маркеров и линий с единичными хромосомными замещениями для картирования генов с известной хромосомной локализацией.(7)

 

Генетические карты пшеницы

Определение карт сцепления  генов пшеницы обеспечивает базу для картирования генов, ответственных  за экспрессию интересующих нас признаков. На пшенице такие карты также обеспечивают цитологические свидетельства основных хромосомных перестроек и делают возможным составление сравнительных карт близких видов.

Первые RFLP-карты были составлены для гомеологичных хромосом группы 7. После этого были составлены карты хромосом групп 3, 2, 5, 4, 7 и 6. В общей сложности составленная объединенная генетическая карта сейчас содержит более 500 локусов. (6)

Другая важная популяция  для картирования была получена в  CIMMYT путем скрещивания синтетической (амфигексаплоидной) пшеницы (Aegilops tauschii [syn. Triticum tauschii] x Altar 84 durum) с сортом яровой мягкой пшеницы Opata 85 и была генотипирована в Корнельском университете в США. Использование такого скрещивания привело к созданию популяции с очень высоким уровнем полиморфизма, благодаря чему была создана очень подробная карта (около 1000 RFLP-локусов). Недавно с использованием SSR-маркеров была составлена т.н. ITMI-карта, на которой расположено 279 SSR-локусов. (2)

На основе RFLP были сконструированы ряд физических карт с использованием делеционных линий сорта Chinese Spring. Эти делеционные линии также были использованы для конструирования на основе SSR физической карты хромосом группы 2. В общем, генетические карты выявили более низкий уровень полиморфизма в геноме D .

Более того, большое число  RFLP-локусов и достаточное количество микросателлитных локусов используются для локализации хромосомных плеч с использованием линий нуллисомиков-тетрасомиков и дителосомиков.

На сегодняшний день известно более 850 тысяч EST для пшеницы; с использованием SNP-маркеров создана карта, включающая более 16000 EST-локусов.(7)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Картирование  единичных или главных генов

В последние 5 лет было картировано в специфических хромосомных регионах большое число генов с различными функциями. Таблица 3 включает большую часть этих генов, контролирующих устойчивость к болезням и вредителям, устойчивость к стрессу, качество и другие признаки. К данным результатам привели несколько стратегий картирования/маркирования с использованием в основном RFLP и RAPD-маркеров. Как видно из таблицы 3, несколько RFLP- и RAPD-связанных маркеров были затем переведены в маркеры на основе ПЦР, которые являются более надежными, такие как STS, SCAR и ASA.

Существование многочисленных наборов практически изогенных  линий (NIL), различающихся присутствием или отсутствием одного аллеля устойчивости облегчило картирование генов, для которых такие линии существуют; например, такие линии существуют для генов Pm1, Pm2 и Pm3, кодирующих устойчивость к ложной мучнистой росе, Lr9 и Lr24 – к бурой ржавчине, Bt-10 – к твердой головне, Yr15 – к желтой ржавчине.(2) Серии NIL сорта Newton были обследованы на аллели устойчивости к гессенской мухе с использованием 1600 рандомных 10-нуклеотидных праймеров. Для каждого из 11 маркируемых генов было идентифицировано от 1 до 3 RAPD-маркеров, а также определено сцепление данных генов путем скрининга F2-популяций отдельно для каждого гена. NIL сорта Thatcher были обследованы по гену устойчивости к бурой ржавчине Lr, расположенному на длинном плече хромосомы 5D, с использованием 37 RFLP-зондов к хромосомам 5-й группы, и после тестирования популяции F2 между Thatcher и Lr1/Thatcher обнаружили, что 3 из них связаны с геном Lr1. Схожий подход был использован для гена Cre1, который определяет устойчивость к овсяной цистообразующей нематоде, для которого обнаружили 2 RFLP-маркера, фланкирующих данный ген на длинном плече хромосомы 2В. (5)

Когда хромосомная локализация  определенного гена известна из предыдущих генетических исследований, но нет  доступных NIL, можно использовать  маркеры, картированные для данной хромосомы, чтобы оценить родительские линии на полиморфизм, сконструировать карту единичной хромосомы и определить, какой маркер является наиболее близким к гену интереса. Эта стратегия использовалась при маркировании локус Kna1 в пшенице, ответственного за большее накопление калия по отношению к натрию (К+/Na+) в листьях – признак, коррелирующий с более высокой солеустойчивостью.(9) Популяции для картирования были получены путем скрещивания линий, схожих генетически, но отличающихся 1 хромосомой, беккроссирования с моносомными линиями по изучаемой хромосоме, идентифицирования моносомных растений с гемизиготной рекомбинантной хромосомой, самоопыления данных растений и обнаружения рекомбинантов-дисомиков. Несмотря на трудности в создании таких популяций для картирования, основным преимуществом, которое они предоставляют, является оценка фенотипического эффекта гена интереса без эффекта смешивания других генов (или других хромосом), вовлеченных в экспрессию того же признака.

Метод BSA (bulk segregant analysis), разработанный для маркирования генов устойчивости к болезням у салата-латука, были успешно применены на пшенице. Данный подход в основном используется с RAPD-маркерами (для генов устойчивости к мучнистой росе Pm1 и Pm2) хотя сейчас он используется и с AFLP-маркерами.(2) И та, и другая маркерная технология используются для скрининга 2 объемов образцов ДНК из индивидуальных растений, идентифицированных из популяции, расщепляющейся по интересующему нас признаку. В 2 образцах все локусы должны быть одинаковы, кроме региона генома, связанного с целевым геном, по которому расщепляется популяция. Для преодоления проблем ограниченной воспроизводимости RAPD-маркеров, и учитывая, что повторяющиеся последовательности часто амплифицируются, BSA и RAPD используют на ДНК, обогащенной низкоповторяющимися (низкокопийными) последовательностями. В результате наблюдалось значительное улучшение воспроизводимости и повышение выявленного уровня полиморфизма по сравнению с необогащенной ДНК. Технология AFLP имеет преимущество перед RAPD – большое число фрагментов ДНК, амплифицируемых с 1 комбинацией праймеров, а проблема высокоповторяющейся ДНК преодолевается путем использования чувствительных к метилированию нуклеаз, таких как Pst1 и Sse1.(1)

Тот факт, что ряд генов  устойчивости, картированных на пшенице, был интрогрессирован из других видов, объясняет успех их маркирования, т.к. обнаруживается более высокий уровень полиморфизма по сравнению с сегментами, в которых нет перенесенной ДНК других видов.