Генная инженерия

 

ДИНАМИЧНОСТЬ  ГЕНОМА

 Методы новой генетики расширили наши знания о структуре генетического материала. В 1963 году Тейлор описал “индуцированные фагом мутации E. Coli”, вскоре после этого, Старлингер и Седлер описали IS-элементов у бактерий. Эти элементы получили название мобильных, теперь же они определяются как специфические последовательности ДНК, которые могут неоднократно внедряться в разные сайты генома. Перенос генов от одной бактерии к другой с помощью фага (трансдукция) известен давно, а теперь используется и в генетической инженерии эукариот (включая клетки млекопитающих). Возможно, такие процессы могут происходить и в природе. Более того, последовательности ДНК, гомологичные глобиновому гену человека, были обнаружены у бобовых растений. Функция такого гена у растений может состоять в том, чтобы “обеспечить кислородом клубеньковые бактерии в ткани”. Наличие этого гена может быть объяснено переносом его от насекомых или млекопитающих.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 3. Возможности  генной инженерии

 Значительный прогресс  достигнут в практической области  создания новых продуктов для  медицинской промышленности и  лечения болезней человека (табл.2).

 

 

Табл.2 Использование генно-инженерных продуктов в медицине

 

В настоящее время  фармацевтическая промышленность завоевала  лидирующие позиции в мире, что  нашло отражение не только в объёмах  промышленного производства, но и  в финансовых средствах, вкладываемых в эту промышленность (по оценкам экономистов, она вошла в лидирующую группу по объёму купли-продажи акций на рынках ценных бумаг). Важной новинкой стало и то, что фармацевтические компании включили в свою сферу выведение новых сортов сельскохозяйственных растений и животных, и тратят на это десятки миллионов долларов в год, они же мобилизировали выпуск химических веществ для быта. Добавок к продукции строительной индустрии и так далее. Уже не десятки тысяч, а возможно, несколько сот тысяч высококвалифицированных специалистов заняты в исследовательских и промышленных секторах фарминдустрии,и именно в этих областях интерес к геномным и генно-инженерным исследованиям исключительно высок.

 Для чистого вырезания  трансгенного ДНК в растительный  геном, всё больше применяют  заимствованные из микробной  генетики системы гомологичной рекомбинации, такие как системы Cre-lox и Flp-frt. Будущее, очевидно, будет за управляемым переносом генов от сорта к сорту, основанного на применении предварительно подготовленного растительного материала, который уже содержит в нужных хромосомах участки гомологии, необходимого для гомологичного встраивания трангена. Помимо интегративных систем экспрессии, будут опробованы автономно реплицирующиеся векторы.осбый интерес представляют искусственные хромосомы растений, которые теоретически не накладывают никаких ограничений на объём вносимой теоретической информации.

 Кроме этого учёные  занимаются поиском генов, кодирующих  новые полезные признаки. Ситуация  в этой области меняется радикальным  образом, прежде всего, существованию  публичных баз данных, которые содержат информацию о большинстве генов, бактерий, дрожжей, человека и растений, а также в следствии разработки методов, позволяющих одновременно анализировать экспрессию большого количества генов с очень высокой пропускной способностью. Применяемые на практике методы можно разделить на две категории:

 Методы, позволяющие  вести экспрессионное профилирование: субстракционная гибридизация, электронное  сравнение EST-библиотек, «генные  чипы» и так далее. Они позволяют  устанавливать корреляцию между  тем или иным фенотипическим признаком и активностью конкретных генов.

 Позиционное  клонирование, заключается в создании за счет инсерционного мутагенеза мутантов с нарушениями в интересующем нас признаке или свойстве, с последующим клонированием соответствующего гена как такового, который заведомо содержит известную последовательность (инсерция).

 Вышеназванные методы  не предполагают ни каких изначальных  сведений о генах, контролирующих  тот или иной признак. Отсутствие  рационального компонента в данном  случае является положительным обстоятельством, поскольку неограничен нашими сегодняшними представлениями о природе и генном контроле конкретного интересующего нас признака.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 4. Области практического применения генной инженерии

4.1. Создание трансгенных растений

 

 В апреле 1998 года  доля в процентах трансгенных  форм растений в сельском хозяйстве  составило: 

• кукуруза – 6
• соя – 12
• хлопчатник – 15
• томаты – <1

 Отсчёт истории  генетической инженерии растений  принято вести с 1982 года, когда  впервые были получены генетически трансформированные растения. Метод трансформации основывается на природной способности бактерий Agrobacterium tumefaciens генетически модифицировать растения. Реконструированные штаммы Agrobactrium, содержащие неонкогенные варианты Ti-плазмид и обладающие повышенной вирулентностью, стали основой одного из наболее популярных методов трансформации. Первоначально трансформация применялась для генно-инженерных двудольных растений, однако работы последних лет свидетельствуют, что этот метод эффективен и в отношении кукурузы, риса, пшеницы.

 Генетические изменённые  растения с устойчивостью к  различным классам гербицидов  в настоящее время являются  наиболее успешным биотехнологическим  продуктом. Дело в том, что  биотехнология позволила совершить такой прыжок, так как оказалось возможным генетически изменять устойчивость растений к тем или иным гербицидам либо путем введения генов, кодирующих белки, нечувствительные к данному классу гербицидов, либо за счет введения генов, обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов растений. К настоящему времени клонированы гены, кодирующие нечувствительные к действию гербицидов ферменты-мишени, что дало возможность получать трансгенные растения, устойчивые к таким гербицидам, как глифостат и хлорсульфуроновым, и имидазолиноновым гербицидом. Изолированы также гены, которые кодируют ферменты деградации некоторых гербицидов, что позволило получить трансгенные растения устойчивые к фосфинотрицину и далапону. В 1997 году устойчивая к Roundup соя, распространяемая компанией "As Grow", была признана в США сельскохозяйственным продуктом года.

Так как множество  растений подвержены нападению и  поеданию со стороны насекомых, то ученые генной инженерии провели эксперимент  с давно известной бактерией Bacillus-Thiringiensis, которая продуцирует белок, оказалось она является очень токсичной для многих видов насекомых, но в то же время безопасна для млекопитающих., белок (дельта-эндотаксин, CRY-белок) продуцируется различными штамами Bacillus-Thiringiensis. Это прототаксин который расщепляется в кишечнике насекомых, образуя активированный токсин. Активизированный белок специфично связывается с рецепторами средней кешки насекомых, что приводит к образованию пор и лизису клеток кишечного эпителия. Взаимодействие токсинов с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-насекомое. В природе найдено большое количество штаммов Bacillus-Thiringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты Bacillus-Thiringiensis в течение десятилетий использовались для контроля насекомых на полях.

 Встраивание гена  этого белка в геном растений  дает возможность получить трансгенные  растения, не поедаемые насекомые.  Но этот метод потребовал большой  работы со стороны генной инженерии,  в плане подборов необходимых штаммов и созданию генно-инженерных конструкций, которые дают наибольший эффект для конкретных классов насекомых. Кроме видоспецифичности по действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно больше адениновых и тиминовых нуклеатидных оснований, чем растительная ДНК. Эта проблдема была решена путем создания модефицированных генов, где один из природного гена вырезали и добавили те или иные фрагменты с сохранением доменов, кодирующих активные части дельта-токсинов. Так, например, с помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому жуку. В настоящее время так называемый Bt – растения хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.2. Изменение свойств сельскохозяйственных технических растений

 Современная биотехнология  в состоянии манипулировать многими  важнейшими признаками, которые  можно разделить на три группы:

 Сельскохозяйственные  производства. К ним можно отнести  общей продуктивности растений за счет регулирования синтеза фитогормонов или дополнительного снабжения кислородом растительных клеток, а также признаки обеспечивающие устойчивость к разного рода вредителям, кроме этого в создании форм растений с мужской стерильностью и возможностью дольше сберегать урожай.

 К признакам которые  влияют на качество продукции,  относится возможность манипулировать  молекулярным весом жирных кислот. Растения будут производить биодеградирующий  пластик, по цене сопоставимой  с полиэтиленом, получаемым из нефти. Открылась возможность получения крахмала с заданными физико-химическими свойствами. Аминокислотный состав у растений запасных белков становится более сбалансированным и легко усвояем для млекопитающих. Растения становятся продуцентами вакцин, фармакологических белков и антител, что позволяет удешевить увеличение разных заболеваний, в том числе и онкологических. Получены и испытываются трансгенные растения хлопка с уже окрашенным волокном, более высоким качеством.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.3. Генетическая модификация пластид.

 Во многих случаях  генетической модификации будут  подвергаться не ядерные геномы, а геномопластит или метохондрия.  Такие системы позволяю значительно  увеличить содержание продукта  в трансгенном материале. 

 В генной инженерии  исследуются следующие направления:

• Управляемая активность генов;
• Селективная экспрессия трансгена в определенных тканях;
• Система экспрессии растения в чужеродной генетической информации, опосредованной вирусами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 5. Генные вакцины

 Вакцины — одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки зрения. Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, пептическая язва желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированная с H. pylori, злокачественные новообразования печени (вирусы гепатита В и С).

Используемые сегодня  вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:

 • живые аттенуированные  вакцины; 

 • инактивированные  вакцины; 

 • вакцины, содержащие  очищенные компоненты микроорганизмов  (протеины или полисахариды);

•рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии.

 Технологию рекомбинантной  ДНК применяют также для создания  живых ослабленных вакцин нового  типа, достигая аттенуации путем  направленных мутаций генов, кодирующих  вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие иммуногенные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют еще генными, генетическими, полинуклеотидными вакцинами, вакцинами из нуклеиновых кислот.

ДНК-вакцины обладают большим потенциалом и могут вызвать революцию в вакцинологии. Однако многие специалисты не спешат делать окончательные выводы до тех пор, пока не получат достаточное количество данных клинических исследований, убедительно свидетельствующих об эффективности и безопасности ДНК-вакцин. В ближайшие несколько лет не следует ожидать их внедрения в медицинскую практику, поскольку большинство из разрабатываемых вакцин находится на этапе доклинических или проходят I–II фазу клинических исследований

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 6. Генотерапия

Генотерапия и генодиагностика - это перспективные технологии фундаментальной и прикладной биомедицины, направленные на лечение и профилактику наследственных (генетических) и приобретенных заболеваний, в том числе онкологических.

 В основе генотерапии,  развивающейся на базе и в комплексе с генодиагностикой, лежит контролируемое изменение генетического материала клеток, приводящее к "исправлению" не только наследственных, но и, как стало ясно в последнее время, приобретенных генетических дефектов живого организма.

 Важнейшей технологической  задачей генотерапии является  разработка системы переноса  или адресной доставки корректирующего  генетического материала к клеткам-мишеням  в организме больного, несущего  в своем геноме дефектный ген.  Предлагаемые технологии характеризуются точностью выявления гена, ответственного за генетический дефект и выбора системы переноса корректирующих генов, адресностью доставки в организм больного генетического материала, исправляющего генетический дефект.