Шпаргалка по "Геномике"

 СЛАЙД 4.65  Следующим  ферментом является белок интеграза.

По мех-му действия идентичен с транспозазаой. Он связывается с копией транспозона и делает надрезы, но т.к. у нас линейная копия, то надрезы делаютя возле самого конца гена и интеграза отрезает 2 нуклеотида. У нас получается репликатив длиной 2 нуклеотида и к 3Н-конец, эффективному для интегразы, затем реакция трансэтерификации и внедрение ДНК в клетку реципиента. После репарации разрывов мы получаем полностью интегрированную версию геном. Т.е. мех-зм что у ретровирусов, что у  ретротранспозонов олич фазой упаковке геномной ДНК в капсид,.

 

  СЛАЙД 4.66 У ретровирусов  есть склонность к образованию  онкогенных вариантов. Здесь все  достаточно просто, получается дефектный  вариант. Мех-зм интеграции ретровиросов  надежный. Происходит много рекомбинациооных  событий с достаточной большой частотой, особенно при следующей упаковки геномной копии ДНК в вирусный капсид. Поэтому формируется дефектный вариант ретровируса, который вместо части вирусного генома  перехватывает соседний ген.

 На слайде показан  онкоген. Мех-зм процесса это либо рекомбинация, либо делеция фрагмента, т.е. 2 копии фрагмента оказываются рядом

 

РИСУНОК

Стрелками обозначены повторы, а здесь какой-то ген располагается. При делеции одного из конца получается включение гена в состав ретровируса. Если уберем один из фрагмента , то онкоген включится в состав одного из транспозона ( в зависимости от того, какой уберетсяa фрагмент). ОДНА ИЗ НИХ не жиЗЕНСПОСОБНАЯ ВЕРСИЯ, ОДНА ИЗ НИХ НОРМАЛЬНАЯ(т.к.  должна  экспрессироваться транспозаза). 

 Такая версия нормальная, только перемещение транспозона будет не очень эффективным, но т.к. большинство ретровирусов покуют 2 молекулы вирусной РНК, то перемещение возможно, т.к. может упаковаться и нормальная РНК вируса. Тогда получаем инфекционную частицу, которая будет приводить к злокачественным трансформациям в клетке,т.к. онкоген присутствует.

 СЛАЙД 4.68  пример  транспозона- Ту-элемент  у дрожжей. Стандартный эукариотический транспозон,разме генома больше 5000 н.п. и с него получается 2 транскрипта( 5.7 и 5.0 т.п.н.), которые учавствуют в перемещении. Белки, которые синтезируются этим транспозоном- 2.  Белка туА больше, за счет сдвига рамки получается гибридный белок ТуА и ТуВ. Один кодирунт полимерезу и интегразу, а другой- остаток gag – белка ретровируса. Часть Ту-элементов дрожжей сходны с ретровирусами и доказ-во –электронная картинка справа. Т.Е. Ту-элементы способны формировать вирусоподобные частицы, но что-то у них дефектно и такие частицы неинфекционные

 СЛАЙД 4.69 основной  транспозон у дрозофилы . разме  чуть больше 5000 н.п., на концах прямые повторы, ограниченные инвертированнымию. В разных штаммах может присутствовать несколько десятков копий такого элемента может присутствовать

 

СЛАЙД 4.70 структура LINE-элемента . нгеретровирусоподобные транспозоны, имеют другую структуру и перемещаются по-другому. Тут представлен главный транспозон в нашем геноме, который способен перемещаться.он один, онон и хорошо, т.к муткгенный эффект снижен.

Его полный размер около6000 т.н.п.( стандатр для большинства  эукариотич транспозонов) и на концах poly-A последовательность- это единственный признак МГЭ, поэтому иногда наз-ся poly-a содержащие транспозоны. Внутри гена располагается 2 рамки считывания. Вспомогательная ORF1- учавствует в транспозиции, но что конкретно делает не понятно. И ORF2- это рамка, которая кодирует полипротеин с 3-мя активностями( обратная транскриптаза и РНКазная активность и экзонуклеазная-в самом начале поледовательности присутствует). Также есть небольшой нетранслирующий участок на конце 5'UTR . Промотор перед ORF1. То, что это за промотор кретично  для перемещения транспозона.

Вспомни молекулярную биологию: расположение и своиства РРНКпромоторов у эукариот.

Рисунок стр 36

РНК-pol 1

РНК-pol 2

РНК-pol 3

РНК-pol 3 является уникальной. Промотор располагается внутри транскрипта, после точки с которой начинается считывание. Промотор должен кодироваться самим элементом,а т.к. это ретротранспозон, то это может быть промотор под РНК полимеразу-3. Для ретровируса стандартный промотор для РНК-полимеразы-2, при этом используется сложная система для репликации концов, чтоб достроить промотор до конца, т.е.  участок, который не транскрибируется изначально. Здесь у ретровируса промотор оказывается в конце транскрипта, а затем переносится при синтезе ДНК копий. У этих транспозонов промотор сразу присутствует,и не надо использ овать мех-зм репликации сложных повторов.

Все начинается с перемещения  транспозонов.

1. эндонуклеаза делает надрез в том месте, где должно произойти внедрение ретротранспозона. Чтобы произошло внедрение кретично, чтобы рядом высокая концентрация А ,чтобы polyA –хвост транспозона мог спариваться. polyA –хвост является функциональным элементом, обеспечивает спаривание РНК-транспозона с матрицей.
2. Гдето в этот же момент эндонуклеаза делает второй надрез молекуле реципиента.
3. Затем за счет обратной транскриптазной активности идет синтез ДНК копий геномной ДНК транспозона.( как происходит: есть матрица, обратная транскриптаза синтезирует РНК копию, когда она доходит до конца происходит встраивание копии в геном)механизм синтеза второй цепоцки не совсем понятен,но часть транскриптаз способны цепочку завернуть на себя, образовать шпильку, которая является хорошей матрицей.

 

 

СЛАЙД 4.72

 

Тоже самое, немного другой механизм. Сначала тоже самое

1. надрезание реципиентной молекулы в 2  точках ( виден надрез и место спаривания polyA-хвоста);
2. Обратная транскриптаза связывается с субстратом и  идет синтез кДНК-копий

По этой схеме  фермент режит оба конца и  не дает им разойтись.

Когда синтез доходит до конца , то начинается синтез второй цепочки. За счет такого мех-зма  получаем интеграцию LINE-элемента ДНК. Скорее всего срабатывают стандартные клеточные системы репарации ДНК. Так или иначе мы получаем копию LINE-элемента в новом месте.

 

СЛАЙД 4.73

Теперь, когда мы представляем мех-зм перемещения МГЭ, сравним ДНК- транспозон и РНК- транспозон.

 В качестве  транспозона LINE-элементы, поскольку  они хороши. Когда мы рассматривали  ДНК транспозон,  мы говорили  о мех-зме в бактериальной клетке  и там ситуация проще, т.к.  нет ядерной оболочки.

 В эукариотической  клетке, чтобы транспозон переместился  должна произойти транскрипция  генов транспозазы:  идет транскрипция, синтезируется РНК, получаем белок  транспозазу, белок транспортируется  обратно в ядро и концы транспозона  с ними связались. Транспозаза способна связаться с любой парой инвертированных повторов и делеционный вариант транспозона получается инвертированным, т.к. концы близко располагаются. Т.е за счет такой ситуации ДНК транспозоны накапливают делеционные производные, что приводит к вымиранию семейства транспозона.

Теперь на РНК  виру посмотрим, что характерно для LINE-элемента. Все начинается также, разницы нет: синтез РНК, попадает в  цитоплазму, идет синтез белка РНК, а дальше ОТЛИЧИЕ т.к. для белка, который должен связаться с РНК ретровирусом, субстратом служит РНК, заканчивается синтез эндонулеазы и обратной транскриптаз( это один белок), он связывается с РНК транспозона и комплексом  транслируется в ядро и происходит интеграция его. В геноме есть делеционные версии LINE-элемента, но большинство делеций утрачивает polyA –хвост  и синтез РНК, ДНК копий на второй цепи не доходит до конца. Если утрачивается начало LINE-элемента, то не т промотора, не идет транскрипция.   Если утрачивается конец, то не идее интеграция. В результате  такой мех-зм работает с полноразмерными копиями, никакие делеционные произволные не смогут перемещаться. РolyA –хвост может распознаваться, но распознование идет той РНК, которая является матрицей. Соответственно полноразмерные элементы перемещаются,а делеционные производные неактивны. Разница в том, что ЗДЕСЬ  делеционные производные способны перемещаться за счет транспозазы,а для ретровирусов нет. Поэтому реировирус может делать множество копий в геноме  самого себя и это не влияет на перемещение. Поэтому в большинстве эукариотич генома ретровирусы способны активно перемещаться. И чаще в ретротранспозонах представлено много МГЭ, в частности LINE- семейство их много получается.

 СЛАЙД 4.74 Еще одна функция, которую выполняют неретровиросоподобные транспозоны связана с активным формированием псевдогенов под действием белков. Здесь будет небольшое противоречие, потому что для того, чтобы псевдоген образовался необходимо , чтобы ферменты вируса связались с интероктивной матрицей. С невысокой вероятностью ретровирусные белки способны распознавать стандартный клеточный транскрипт. Т.к. тут есть polyA –хвост  - он инициирует интеграт ретровируса, с высокой вероятностью белки LINE-элемента распознают стандартные транскрипты и  используют их в качестве субстрата для внедрение в геном. В результате получаем внедрение в геном кДНК копий станд клет транскрипта. Этот процесс редко доходит до начала гена, но т.к. речь идет о транскриптах для РНК полимеразы 1 и 2 промотора не будет. Даже если полностью полноразмерная матричная РНК получится, то она будет не функциональна, т.к. не будет промотора. Но такие процессы идут и в наших геномах

Процессы формирования псевдогенов  идут с разной эффективностью в разных геномах. Есть как минимум 1 пример геномов,у  которых эффективно шли такие процессы формирования псевдогенов. Это геном хлебных дрожжей. Это чуть ли не единственный прокариотич геном, в котором отсутствует интроны. Только 5% гены интроны имеют, но даже там, где они присутствуют, они в некодирующей части. Геном хлебных дрожжей содержит полный набор псевдогенов, которые содержат интроны. Это один из минимальных эукариотических геномов и если убрать интроны, то геном получается компактным. Такие процессы идут медленно, т.к. нужно сделатькопию и еще провести под промотор (должны произойти 2 события, которые совпад по времени).

Несмотря на то, что я  говорил, что делеционные элементы LINE-элемента не перемещаются, наблюдается 1 парадокс. Почти каждое сем-во  LINE-элементов  имеют небольшие элементы, которык  случат механизмом LINE-элементов для перемещения

 СЛАЙД 4.75 В частности у нас в геноме  етnm Alu последовательности . она перемещается точно так же как LINE-элементы, используя обратную транскриптазу интегразу L1-элемента, для внедрения в новый сайт генома, Но не происходи отлагания? К этому приводит 7SL РНК? (мы о ней должны помнить, плохо слышно, на рисунке неясно) Важная клеточная РНК молекула, которая необходима клетке. В состав Alu входят 2 фрагмента: одно плечо и второе плечо. Скорее всего произошла какая-то дупликация , т.к. polyA –хвост  есть и там, и там. Еще одно отличие от исходной ДНК- это 2 инсерции( в правом плече и в промоторе). Как это все перемещается? Так же , как и в LINE-элемент. Распознает LINE-элемент polyA –хвост , обеспечивает внедрение, а промоторы, которые распологаются обеспечивают транскрипцию самого элемента и дают большое количество транскриптов Alu последовательности. Название этот фермент получил от рестриктазы, которая режит в праволм плече

Слайд 4.76 это  наш с вами геном и очень  приблизительные цифры, т.е % генома, который занимает МГЭ. Например 3% занимает ДНК-транспозоны длиной 2-3 т.п.н.. Ну а дальше в таблице все понятно.

 

здесь в очент  упрощенной форме показано что может  с геномом происходить когда  есть повторы. Те самые транспозоны, о которых только что говорили- это универсальные блоки гомологии, которые расположены по всему геному в огромном количестве копий. Между копиями могут происходить рекомбинации. Если посмотреть, то  На одной хромосоме расположены 2 копии транспозона,  они в одной ориентации, между ними гомологичная рекомбинация и мы получаем вырезанную кольцевую молекулу и укороченную хромосому. В зависимости от того куда попала центромера, молекула либо будет реплицироваться , либо нет (т.к нет центромеры т теломеры).

Если копии  транспозона расположена там же, но на противоположенной хромосоме, то произойдет инверсия.

Если копии  на разных хромосомах могут спариваться  разные копии, которые формируются  в ходе мейоза. Получается транслокация.

 Все рекомбинационные  процессы происходят с высокой вероятностью, но они не сильно плохое влияние оказывают.

 

В генома прокариот меньше МГЭ!!!!!!!

 

Вопрос  № 12. Организация геномов Homo sapiens и Pan troglodytes.

Организация генома Homo sapiens.

В ядре каждой соматической клетки человека содержится 23 пары хромосом. На каждую из них приходится по одной молекуле ДНК. Длина всех 46 молекул в одной клетке тела человека равна почти 2 м, а если учесть, что тело взрослого человека составлено примерно из 5 " 1013 клеток, то общая длина молекул ДНК в организме достигнет 1 " 1014 м, или 1 " 1011 км, что в тысячи раз превышает расстояние от Земли до Солнца. Во всех молекулах ДНК одиночной клетки человека содержится 3,2 млрд пар нуклеотидов. В 1996 году считали что количество генов челоека колеблется на уровне 100 тыс., затем 80 тыс. В конце 1998 года специалисты по биоинформатике начали склоняться к мысли, что на самом деле нужны более осторожные оценки и что в геноме человека может оказаться 50-60 тыс. генов. Важно подчеркнуть, что на их долю приходится только 3% общей длины ДНК человека. Функциональная роль остальных 97% остается пока непонятной.

ЧТО ТАКОЕ ПРОЕКТ "ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА"

Цель проекта  заключается в выяснении последовательности оснований во всех молекулах ДНК  в клетках человека. Одновременно должна быть установлена локализация всех генов, что помогло бы выяснить причины наследственных заболеваний и этим открыть пути к их лечению. В выполнении проекта задействовано несколько тысяч ученых, специализирующихся в биологии, химии, математике, физике и технике. Это один из самых дорогостоящих научных проектов в истории цивилизации. В 1990 году на изучение геномов было потрачено 60 млн долларов, в 1991 году - 135 млн, в 1992-1995 годах ежегодно выделялось от 165 до 187 млн долларов, а в 1996-1998 годах только США расходовали 200, 225 и 253 млн долларов ежегодно.