Шпаргалка по "Геномике"

На самом  деле если посмотреть по какому принципу отбирались бактериальные геномы на секвенирование: сначала отбирались патогенны, а потом объекты которые представляют ценность для биотехнологии, и только сейчас вот пошли секвенировать всяких прочих бактерий в основном чисто научных интересах.

Вопрос  № 3. Молекулярные маркеры, используемые при картировании геномов (RFLP, SSLP, SNP, STS).

Теперь давайте  разберемся   с картированием  которое является следующим шагом  при стандартном иерархическом  подходе. Есть два принципиально  разных подхода к картированию: классическим можно считать генетический подход (Морган на дрозофиле). Сейчас генетическое картирование идет с применением современных молекулярных методов. Ну и физическое картирование. В чем различие? Различие в том принципе который лежит в основе определения расстояния между локусами на карте. И тот и другой вариант картирования представляет собой определение положения каких-то маркеров на ген. карте. Будь то гены, какие-то молекулярные маркеры. Всегда речь идет об относительном расположении этих маркеров в какой последовательности они расположены и на каком расстоянии. Критерием расстояния при ген. Картировании служит частота рекомбинаций между маркерами. При физическом картированием – реальная физ. Величина, это может быть непосредственное измерение расстояния между маркерами. Если можно их увидеть в микроскоп либо косвенное определение физ. расстояния. Методом электрофореза, к примеру , по подвижности фрагмента в геле определяется его молекулярная масса, а она соответствует длине фрагмента и можно пересчитать количество н.п. по приблизительно определенной молекулярной массе.

Давайте начнем с генетического картировании. Само картирование очень простое –  делается скрещивание, считается число  рекомбинатов и по это частоте  определяют  расстояние. Разница  заключается в то что помимо классических маркеров и генов используется еще и целый спектр молекулярных маркеров. Наиболее часто встречаемые здесь представлены (СМ СЛАЙД 4.14).

 

 

 Под генами  в плане ген картирования обычно  подразумевают не любые гены, а только те инактивация которых  имеет фенотипическое проявление. Удобство этого маркера заключается в том, что его присутствие или отсутствие можно легко детектировать просто посмотрев на фенотип организма. Молекулярные маркеры не позволяют этого сделать т.е. они детектируются молекулярными методиками. Давайте сейчас по очереди разберемся с этими слайдами.

Первый из этих маркеров полиморфизм длин рестрикционных фрагментов. (СМ СЛАЙД 4.19)

 

 

Все сводится к  тому – есть ли определенный сайт в  определенном месте или он отсутствует. Сайт стандартной рестриктазы, на самом  деле разница между этими аллелями составляет 1 букву. У нас есть 2 представителя из популяции мы сделаем ДНК, в случае человека будут определенные различия между геномами, с высокой долей вероятности часть из этих различий является показателем сайта для определенных рестриктаз. Соответственно если сайт присутствует - на один фрагмент больше получается при рестрикции, если сайта нет – на один фрагмент меньше. Сложность заключается в том что нужно эти фрагменты детектировать. Стандартный, предложенный первым, метод детекции полиморфизма рестрикционного это гибридизация по Саузену (СМ СЛАЙД 4.20). Суть сводится к тому что делается ДНК-зонд, перекрывающий полиморфный сайт и затем это зонд гибридизуется с обработанной рестриктазами ДНК. Обычно последовательность действий такая (СМ СЛАЙД 4.20): сначала идет рестрикция в стандартной пробирке, затем агарозный электрофорез, после – перенос на мембрану, на нее накладывается рентгеновская пленка, получается радиоавтограф и после проявления пленки сколько получилось полосок. Если вот этот сайт присутствует то, соответственно, 2 фрагмента, которые катализирует ДНК-зонд. Если сайт отсутствует – 1 фрагмент.

 

 

 

 

 Неудобства  этой методики заключаются в  том, что во-первых нужно делать  радиоактивный зонд, во-вторых трудоемкая  и длительная процедура детекции и занимает пару дней. ПЦР гораздо удобней в этом плане (СМ СЛАЙД 4.21).

 

 

 

 

 Здесь все  предельно просто берутся праймеры  по обе стороны от рестрикционного  сайта полиморфного, идет амплификация  получается фрагмент  который  соответствует ДНК-зонду  и  затем полученный продукт подвергается  рестрикции. Если сайт есть ПЦР  фрагмент будет разделен на 2 части, если сайта нет – остается 1 фрагмент. Преимущество ПЦР в том что трудоемкость меньше, скорость выше. Как подбираются праймеры? Мы знаем где располагается полиморфный сайт и подбирается слева и справа на расстоянии нескольких сот н.п. Здесь возможно 2 подхода к детекции этих полиморфизмов. Такие маркеры можно использовать когда даже  неизвестная геномная последовательность, тогда  берутся случайные пары праймеров, определенного размера, они режутся всеми рестриктазами, которые попадаются под руки (делается на разных образцах ДНК), рано или поздно находятся те которые дают разную картину рестрикции.

 Другой маркер, который довольно часто используется и в некоторых случаях он даже удобнее, это полиморфизм длин простых последовательностей. В чем здесь суть? В геномах большинства организмов, особенно эукариотических, присутствуют повторы различных классов. То что представлено здесь называется микросателлитами (СМ СЛАЙД 4.22).

 

Это повтор 2, 3, 4 букв подряд. Аллели таких локусов  отличаются друг от друга количеством повторов. На слайде в одной аллели 3, а в другой – 5. Откуда берутся различные аллели? Днк полимераза когда она реплицирует такой полиморфный локус, особенно когда он достаточно длинный, с достаточно высокой вероятностью проскальзывание. Рестарт сиквенса может произойти не с той позиции, с соседней. Полимераза может отодвинуться на отдвинутся на один подход назад, с несколько меньшей вероятностью она пожжет отодвинутся на один подход вперед. Такое проскальзывание производит немного другой механизм. И в ту и в друю сторону движения возможны. В результате, на один или несколько повторов может уменьшиться количество или увеличится. Если микорсателлитный локус присутствует в геноме, то в обязательном порядке будет … локусов организма потому что так работает ДНК-полимераза.

 

 

 

Любые  варианты которые также могут отслеживаться  это минисателлиты, размеры у них до 25 н.п. Здесь немного другой механизм их появления, но тем не менее тоже известен достаточно хорошо, также аллели  в популяции присутствуют, синоним для этого типа повторов – VNTR. Они могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров. Микросателлитные локусы используются для экспортизации сортов растений, как маркеры в селекции. Это очень удобно т.к. если мы знаем где локус расположен, подобрав пару праймеров слева и справа этого локуса и прогнав ПЦР, мы получаем фрагменты которые в зависимости от размера локуса подвергаются либо агарозному либо полиамидному электрофорезу. При использовании полиакриламидного электрофореза берутся, как правило, микросателлитные локусы. Чем это удобно? Те что полиакриламидные электрофорезы для небольших фрагментов, несколько сотен н.п., позволяет определить их рпзмер с точностью до одного нуклеатида, в отличии от агарозы – точность ее меньше. Реакция примерно такая же как секвенирование, только здесь не надо делать терминацию, просто метятся флуоресцентной меткой эти фрагменты, затем они в соседних дорожках разгоняются (про аппарат в универе). (СМ СЛАЙД 4.24)

 

 

 

еще один тип  полиморфизма, который дает еще один молекулярный маркер, полиморфизм  по одиночным нуклеотидам (СМ СЛАЙД 4.25).

 

 

 

 

 

 

 

 

Здесь все просто, произошла где-то в геноме замена – это отличие, которое можно детектировать и в частности полиморфизм рестрикционных  фрагментов это один из вариантов детекции такого полиморфизма, просто эта замена попадает на рестрикционный сайт. Если не привязываться к рестрикционным сайтам, получается большее число таких полиморфных локусов, больше разнообразие, легче  их найти, но сдугой стороны сложнее их детектировать. Принцип детекции здесь почти всегда основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов (СМ СЛАЙД 4.26) с исследуемой ДНК.

 

 

 

 

Если относительно короткий олигонуклеотидный зонд полностью  комплементарен  геномной последовательности, то он гибридизуется полностью и эту гибридизацию можно детектировать несколькими способами, о них позже.

Если есть хоть одно неспареное основание и  находится  в середине этого зонда, то при  правильно подобранных условиях гибридизации - оно не пойдет. Гибридизация должна идти в достаточно жестких условиях и тогда одна неспареная пара оснований  предотвращает гибридизацию. Остается только детектировать эти два состояния – гибридизованный зонд и не гибридизованный зонд. Один из способов детекции, того что называется молекулярным бакеном (СМ СЛАЙД 4.27).

 

 

 

Вот эта часть  бакена является вот этим самым зондом (на картинке подпись – олигонуклеатидный  зонд), который комплементарен ДНК, эта часть отожженная с .. По обе стороны от комплементарного участка располагаются самокомплементарные последовательности которые могут формировать шпилечную структуру. К 5-прим, 3-прим концу присоединяются 2 флуорофора, один из них стандартный флуорофор, а другой является гасителем флуоресценции, флуорофор который не испускает флуоресценции. Такой структуре если облучить раствор содержащий молекулярные маркеры в шпилечной форме, флуоресценция метки полностью поглощается гасителем флуоресценции и в результате ничего не светится, флуоресценция не детектируется. Если бакен гибридизуется с ДНК, флуорофор и гаситель флуоресценции оказываются разделены в пространстве и флуоресценция резко возрастает, она детектируется и ее четко можно увидеть. Гибридизация будет идти, если здесь есть полное соответствие зонда мишени если его нет, бакен будет оставаться шпилечной структурой. Детектировать это все в планшетном формате, в 96 луночной планшетке на специальных приборах предназначенных для считывания флуоресценции. Можно также детекцию осуществлять в ПЦР- амплификаторе с модулем детекции реагирования. Недостатком является то что нужно ставить реакцию гибридизации фактически отдельно в пробирочном или планшеточном формате.

 

5. Векторы, используемые в геномных проектах.

 

Что такое вектор вы должны представлять. Векторы которые  используются в геномных проектах – 4 типов ( СМ СЛАЙД 4.8.).

 

 плазмиды, фаговые  векторы , космиды и искусственные  хромосомы. Здесь нужно разобраться  с особенностями, чем хороши  каждый из этих векторов, когда  их можно использовать, когда  нельзя.

Ну эта плазмида вам хорошо известна, я думаю (СМ СЛАЙД 4.9). Это основная рабочая плазмида всей молекулярной биологии, включая геномику.

 

 

 

 

 

Наиболее часто  используемый вектор. Он хорош своим  малым размером, удобным селективным  маркером и очень высокой копийностью. Число копий этой плазмиды доходит до тысячи, причем искусственно можно загнать еще и выше, там уже начинаются проблемы со стабильностью. Чем хороша высокая копийность и малый размер? Тем что легко приготовить большое количество ДНК и хорошего качества т.е. эти векторы идеально приспособлены для того чтобы использоваться для приготовления ДНК для секвенирования. Что первого, что второго поколения секвенаторы все-таки требуют достаточно хорошего качества ДНК. Чем качество лучше тем меньше потом проблем. Могут быть 90% всех геномных последовательностей, которые в базе данных сейчас есть – получены с помощью этого вектора или аналогичных векторов такого же размера и такой же последовательности. Почему не 100%? Потому что есть целый ряд недостатков у таких плазмид и на слайде они перечислены. Ограниченная емкость которая неразрывно связана с нестабильностью крупных инсерций  т.е. в принципе в такую плазмиду можно поместить фрагменты и по 50 тыс. н.п. но тогда хуже идет трансформация и главное – нет гарантий того что вот эта вставка не изменяется при культивировании бактерии, наоборот есть достаточно высокая вероятность того, что будут происходить делеции и какие-то реорганизации этой ДНК, что приходилось наблюдать многократно. Поэтому стараются реально в таких плазмидах клонировать куски от тысячи до двух н. п. и не более того. При таком размере вставок они кажутся достаточно стабильными и нет проблем с реорганизацией и потенциальной токсичностью для клеток. Токсичность это еще один важный фактор. Некоторые фрагменты ДНК, что бактериальной, что эукариотической в принципе невозможно клонировать по целому ряду причин одной из которых является токсичность некоторых генов. Токсичными могут быть не только некоторые гены, определенные структуры ДНК, которые блокируют репликацию и мешают работе аппарату синтеза ДНК. Но это редко бывает. Часто бывает что какой-нибудь ген в одной копии клетка нормально переносит, а если 1000 копий такого гена соответственно гораздо больше продукта этого гена, то это может оказаться токсичным даже если это той же самой E. Coli , а тем более если это чужеродный какой-то ген. Многие чужеродные белки оказываются токсичными и соответственно целиком эти гены клонировать нельзя. Поэтому какие-то фрагменты не клонируются. К примеру для дрозофилы помимо конкретных фрагментов т.е. они в принципе не удается клонировать бактериальный…, гетерохроматиновую ДНК, по целому ряду причин, даже если очищать от белков, высокоповторяющаяся ДНК чрезвычайно нестабильна и по этой причине последовательность гетерохроматина в геноме дрозофилы до сих пор не известна. Поэтому приходится использовать другие векторы помимо плазмидных которые лишены части этих проблем. Если говорить о проблеме токсичности, то лучше всего эту проблему решает вектор на основе бактериофага. Бактериофаг λ и сходные с ним космиды, которые также можно заставить реплицироваться по фаговому пути. Почему здесь нет проблемы токсичности? Если фаг размножается по литическому пути заражение идет здоровой клетки, фаг использует те ресурсы что есть ему не важна жизнеспособность клетки т. к. он ее все равно убьет. проблемы токсичности снимается поэтому в бактериофагах клонируется много фрагментов ДНК, которые в принципе не клонируются в плазмидных векторах. В любом случае здесь проблема копийности также снята т.к. в одной фаговой головке одна частица, нагрузка на аппарат синтеза ДНК клетки здесь также не играет роли, поэтому то что не клонируется в плазмидных векторах, клонируется в бактериофаговых. Клонировать можно более крупные куски (СМ СЛАЙД 4.10)