Способ получения вакцин

3.2 Инактивированные  или убитые микроорганизмы 
        Вторым общепринятым методом изготовления вакцин является инактивация или умерщвление патогенных микроорганизмов. При таком подходе все антигены возбудителя доступны для иммунной системы, в то время как сам он абсолютно безвреден. Этот метод приемлем в тех случаях, когда патоген не содержит высокотоксичных компонентов и инактивация не нарушает структуры его антигенов. Таким образом производится несколько антибактериальных и антивирусных вакцин, в том числе вакцины против гриппа, гепатита А, бешенства и коклюша. 
        Из-за неспособности к размножению вакцины из убитых микроорганизмов в целом менее иммуногены, чем препараты из ослабленных возбудителей. Для компенсации этого такие препараты обычно вводят в комплексе с адъювантом (например, солями алюминия), повышающим их эффективность. Кроме того, убитые микроорганизмы не способны инициировать полноценный клеточный иммунитет (в особенности формирование цитотоксических Т-лимфоцитов) из-за недостаточной степени включения содержащихся в вакцинах экзогенных антигенов в механизм презентации эндогенных антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса. Несмотря на это, вакцины из убитых возбудителей особенно эффективны для презентации конформационных эпитопов антител поверхности микроорганизмов. 
 
        Производство вакцин, содержащих убитые микроорганизмы, отличается от производства живых ослабленных вакцин лишь тем, что выделенные из культуральной среды возбудители инактивируют с помощью химических соединений, например формальдегида или бета-пропиолактона. Биохимический состав убитых бактерий, как правило, известен недостаточно хорошо, и они могут вызывать определенные побочные эффекты при попадании в организм. В отличие от них вирусы, выделяемые из надосадочной жидкости после разрушения выращенных в культуре клеток, практически не содержат клеточных компонентов. Кроме того, больший по сравнению с другими компонентами культуральных сред размер вирусных частиц обеспечивает возможность высокой степени очистки. Эти характеристики «убитых» вакцин обеспечивают их выбор при необходимости индукции гуморального (антителозависимого) иммунитета против вирусных заболеваний. 
 

3.3 Очищенные или рекомбинантные субъединичные вакцины 
        Использование для производства вакцин целых живых или убитых микроорганизмов исключает необходимость идентификации нужных антигенов, однако обладает потенциальными недостатками в виде необходимости обеспечения безопасности и возможности развития недостаточного или патологического иммунного ответа. С этой точки зрения, если известен иммуногенный антиген, в большинстве случаев более безопасно и эффективно инициировать иммунный ответ избирательно. 
        Многие бактерии (например, возбудитель дифтерии ^ Corynebacterium diphtheriae) синтезируют токсины, вызывающие патологические реакции в инфицированном организме. То, что с помощью нейтрализующих токсины антител можно избежать развития заболевания, известно уже давно, и предназначенные для этих целей вакцины основаны на обезвреженных вариантах токсинов, называемых токсоидами или анатоксинами. 
        Действующие согласно этому же принципу антитела против полисахаридов некоторых покрытых капсулами бактерий (например, ^ Neisseria meningitidis и Streptococcus pneumoniae) известны благодаря своей способности инициировать антибактериальный иммунитет. Поэтому вакцины против таких микроорганизмов в качестве активного компонента содержат выделенные из бактериальных культур и очищенные полисахариды. Такие вакцины обычно эффективны при введении взрослым, но обладают слабым эффектом на иммунитет детей младше двух лет, что обусловлено незрелостью иммунной системы в этом возрасте и независимостью иммунного ответа на полисахариды от Т-лимфоцитов. Этот недостаток можно преодолеть с помощью белков-носителей, обеспечивающих развитие Т-лимфоцитарных реакций против полисахаридов. Например, вакцина против наиболее распространенного возбудителя инфекций дыхательных путей – гемофильной палочки (Haemophilus influenzae B) – производится путем конъюгации очищенных полисахаридов с одним из существующих белков-носителей. 
        И, наконец, рекомбинантные белковые вакцины, синтезируемые клеточными культурами, уже производятся против вируса гепатита В и возбудителя болезни Лайма Borrelia burgdorferi. Еще несколько препаратов находятся на стадии разработки. 

Таблица 1. Основные типы вакцин

 
        4. Изменение в производстве вакцин 
        Стимулом к изменению методов производства некоторых вакцин послужило сразу несколько факторов, в том числе необходимость повышения эффективности, качества и безопасности препаратов, а также практические причины, такие как стремление к простоте и снижению себестоимости производства. В результате процесс производства многих вакцин претерпел ряд изменений. Далее приведены некоторые факторы, подтолкнувшие к внесению изменений в процедуры производства вакцин. 

Таблица 2. Изменения в производстве вакцин

 
        5. Рекомбинантные белковые вакцины 
        К основным причинам, подталкивающим к замене традиционных вакцин на рекомбинантные белковые препараты, относятся следующие моменты: потребность в менее реактогенных и одновременно эффективных вакцинах (например, против сибирской язвы); необходимость создания более безопасных и лучше охарактеризованных вакцин (например, против гепатита В); отсутствие препаратов, обеспечивающих защиту сразу от большого количества серотипов (вариантов) одного и того же вида микроорганизмов (например, возбудителя менингита N meningitidis B). 
        Современная одобренная к применению вакцина против сибирской язвы изготавливается из не содержащего клеток фильтрата культур ослабленного штамма Bacillus anthracis без дополнительного очищения. Процесс производства препарата очень прост, однако получающаяся при этом вакцина содержит большое количество фрагментов бактериальных клеток, которые являются причиной болезни, иногда развивающейся в результате вакцинации. Вакцина нового поколения, в настоящее время проходящая клинические испытания, напротив, представляет собой высокоочищенный антиген, синтезируемый созданными с помощью метода рекомбинантных ДНК бактериальными клетками. Безопасность и эффективность этого типа вакцины необходимо тщательно протестировать, однако, судя по всему, она превосходит современную вакцину, требующую проведения серии из шести иммунизаций и последующих ежегодных инъекций. 
        Современные вакцины против менингита В представляют собой грубые мембранные препараты, содержащие несколько антигенов бактериальной поверхности, индуцирующих синтез бактерицидных антител. Такие вакцины достаточно эффективны, но не обеспечивают защиты от всех многочисленных разновидностей возбудителя N.meningitides. Препятствовать распространению заболевания с помощью таких вакцин можно только в тех случаях, когда заболеваемость в определенной местности вызывается небольшим количеством циркулирующих штаммов. Недавно, в результате полного скрининга генома микроорганизма (подход получил название «обратная вакцинология»), целью которого являлась идентификация универсальных антигенов, появилась экспериментальная вакцина, содержащая несколько белков N.meningitides. Введение препарата животным приводило к индукции синтеза бактерицидных антител, эффективно уничтожающих широкий спектр серогрупп N.meningitides. Сейчас эта вакцина также проходит клинические испытания.  
        Недостатком таких вакцин является то, что они представляют собой смесь рекомбинантных белков, которые синтезируются по отдельности несколькими штаммами

генетически модифицированных бактерий Escherichia coli. Потенциальным подходом к упрощению производственного процесса является объединение нескольких белков в полипротеиновые конструкции, что снизит количество подлежащих синтезу компонентов, не влияя на иммуногенность вакцины. Такой метод уже тестируется на нескольких экспериментальных препаратах. 
        Смещение приоритетов в сторону производства рекомбинантных вакцин привело к появлению продуктов, изготовление которых возможно только с помощью сложных последовательных производственных процессов. Это замедляет появление препаратов нового поколения на рынке, однако усложнение процесса производства должно с запасом окупиться безопасностью и эффективностью конечных продуктов. 
 
        6. Улучшенные противогриппозные вакцины 
        Противогриппозные вакцины содержат вирусные частицы, выращенные в куриных яйцах с развивающимися эмбрионами. Такие частицы выделяют, инактивируют и используют в качестве вакцины против гриппа уже более 60 лет. В последнее время описанный производственный процесс претерпел ряд модификаций. Во-первых, повышена эффективность очистки препарата от реактогенных компонентов. Во-вторых, ученые работают над созданием комбинированных штаммов вируса, в состав которых входят кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу гены циркулирующего штамма, а остальные гены принадлежат стандартному штамму, оптимизированному для культивирования в куриных яйцах. В целом стратегия производства противогриппозных вакцин сохранена в первоначальном виде, что обусловлено низкими доходами, не способными обеспечить достаточных инвестиций в развитие технологии. Однако возросшая в последнее время потребность в вакцине и угроза пандемии гриппа неизбежно ведет к постепенному развитию и этого направления. 
        Ограничения в использовании современных противогриппозных вакцин связаны с их эффективностью, переносимостью и производством. Например, уровня и длительности иммунного ответа, индуцированного вакциной из инактивированного вируса гриппа, достаточно для защиты здорового взрослого человека в течение одного сезона. Совсем неплохо было бы усовершенствовать препарат таким образом, чтобы он мог защищать также детей и пожилых людей и, желательно, в течение более длительного срока. Кроме того, парентеральное введение инактивированных вакцин не приводит к развитию иммунного ответа слизистой оболочки, необходимого для полноценной защиты от этого респираторного патогена.  
        Понимание возможности развития побочных эффектов, а также боязнь инъекций являются основными причинами нежелания людей проходить иммунизацию против вируса гриппа. Лучше переносимые и вводимые менее инвазивными методами вакцины, скорее всего, привлекли бы большее количество желающих защитить себя от заболевания. Живая ослабленная вакцина, наносимая на поверхности слизистых оболочек, в принципе, могла бы инициировать сходный по силе или даже более выраженный иммунный ответ, чем инактивированная инъекционная вакцина. 
        В 2003 году вакцина FluMist на основе адаптированного к холоду вируса гриппа (cold-adapted influenza vaccine, CAIV), разработанная компанией MedImmune Vaccines, получила лицензию в США на интраназальное введение здоровым индивидуумам в возрасте 5-49 лет. Адаптированный к холоду штамм вируса появился в результате культивирования нескольких поколений вируса в культуре клеток при 25 градусах Цельсия, что привело к ослаблению его патогенности. Чувствительность полученного штамма к температуре ограничивает его способность к размножению при введении в верхние дыхательные пути, что практически устраняет его способность вызывать заболевание. Однако он индуцирует как синтез различных классов антител (IgG сыворотки и IgA слизистой оболочки носа), так и появление специфичных киллерных Т-лимфоцитов, что обеспечивает защиту от постоянно меняющего антигенный профиль человеческого вируса гриппа. Сегментирование генома вируса, за счет возможности комбинирования генов гемагглютинина и нейраминидазы циркулирующих вирусов и оставшихся шести генов ослабленного стандартного штамма, облегчает производство вакцинных штаммов как для традиционных, так и для адаптированных к холоду вакцин. Потенциальной проблемой при производстве живых вакцин является нестабильность генома, который может измениться в процессе производства. Однако недавнее исследование не выявило в геномах девяти тестируемых штаммов никаких мутаций, произошедших в процессе производства вакцины. В настоящее время культивация адаптированных к холоду вирусов для производства вакцин также осуществляется в куриных яйцах. 
        Современный метод производства противогриппозных вакцин очень трудоемок, длителен и требует расхода миллионов яиц. Выбор используемого штамма вируса должен делаться за много месяцев до начала сезона повышенной заболеваемости, что значительно повышает вероятность несоответствия вакцины вирусу, для профилактики которого она предназначена. Кроме того, культивирование вируса в куриных яйцах способствует непроизвольному отбору штаммов, способных расти в этих условиях, что еще больше повышает вероятность несостоятельности вакцины. Таким образом, потребность в более быстром и технологически совершенном технологическом процессе очевидна. 
        Одним из возможных решений проблемы является отказ от использования куриных яиц и замена их культурами клеток. Это должно ускорить процесс, повысить его контролируемость и пригодность для производства больших объемов продукции. Кроме того, такой подход исключит вероятность развития аллергических реакций на компоненты куриных яиц. В настоящее время на последних стадиях разработки находятся методы производства противогриппозных вакцин с помощью нескольких клеточных линий и, судя по всему, они довольно скоро заменят традиционно используемые подходы. 
        Дальнейшие усовершенствования работы с клеточными культурами могут быть связаны с использованием методик обратной (реверсивной) генетики, в основе которых лежит обратная транскрипция генов РНК циркулирующих вирусов в ДНК. Такие ДНК-плазмиды, кодирующие антигены вируса гриппа, используются для трансфекции клеток (встраивания чужеродной ДНК в клетку), которые в результате начинают синтезировать вирусные антигены. Этот подход является многообещающей альтернативой сложному и неэффективному процессу создания разнородной популяции вирусов путем инфицирования яиц или клеток. Ускорение процесса производства противогриппозных вакцин за счет использования клеточных культур и методов обратной генетики особенно важно, учитывая постоянно появляющиеся новые штаммы гриппа, в том числе штаммы вируса птичьего гриппа H5N1, способного вызывать заболевание у людей. Кроме того, уменьшение временного промежутка между идентификацией вируса и созданием вакцины снижает вероятность их несоответствия.  
 
        7. Несоответствие объемов производства потребности в противогриппозных вакцинах 
        Сезонная тривалентная противогриппозная вакцина содержит по 15 г вирусного гемагглютинина для каждого из трех типов вируса гриппа (всего 45 г гемагглютинина). Современный мировой объем производства сезонных вакцин с использованием куриных яиц составляет примерно 1 миллиард доз моновалентных вакцин (что соответствует примерно 300 миллионам сезонной трехвалентной вакцины). Если оптимистично предположить, что для профилактики пандемии гриппа достаточно вакцинации одной дозой, содержащей 15 г гемагглютинина, то даже в этом случае современный объем производства позволит провести вакцинирование только 40% мировой популяции, причем лишь за два года. Для обеспечения вакциной всего населения мира потребуется пять лет и более двух миллиардов яиц (на производство трех моновалентных доз затрачивается одно яйцо). Моделирование возможного сценария распространения пандемии гриппа в США показало, что самым эффективным методом снижения количества инфицирований является вакцинация, но лишь в случае доступности и оперативного распространения достаточного количества препаратов. Таким образом, для обеспечения своевременной эффективной вакцинации всего населения мира существующий объем производства необходимо увеличить в шесть раз. В настоящий момент это невозможно из-за недостаточно развитой производственной инфраструктуры и технических трудностей.