Функции нуклеиновых кислот

         Репликационная вилка асимметрична. Из двух синтезируемых дочерних цепей ДНК одна строится непрерывно, а другая с перерывами. Первую назначают ведущей, или лидирующей, цепью, а вторую - отстающей. Синтез второй цепи идет медленнее; хотя в целом эта цепь строится в направлении 3' : 5', каждый из ее фрагментов в отдельности наращивается в направлении 5' : 3' (рис. 3). Благодаря такому прерывистому механизму синтеза, репликация обеих антипараллельных цепей осуществляется с участием одного фермента-ДНК-полимеразы, катализирующего наращивание нуклеотидной цепи только в направлении 5' : 3'.

Рис. 3. Схема механизма роста цепей ДНК при репликации: А-ведущая цепь, Б-отстающая цепь, В-фрагмент Оказаки.

         В качестве затравок для синтеза фрагментов отстающей цепи служат короткие отрезки РНК, комплементарные матричной цепи ДНК. Эти РНК-затравки (праймеры), состоящие примерно из 10 нуклеотидов, с определенными интервалами синтезируются на матрице отстающей цепи из рибонуклеозидтрифосфатов в направлении 5' : 3' с помощью фермента РНК-праймазы. РНК-праймеры затем наращиваются дезоксинуклеотидами с 3'-конца ДНК-полимеразой, которая продолжает наращивание до тех пор, пока строящаяся цепь не достигает РНК-затравки, присоединенной к 5'-концу предыдущего фрагмента. Образующиеся таким образом фрагменты (так называемые фрагменты Оказаки) отстающей цепи насчитывают у бактерий 1000-2000 дезоксирибонуклеотидных остатков; в животных клетках их длина не превышает 200 нуклеотидов.

         Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5' : 3'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З'-конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З'-ОН нового фрагмента ДНК и 5'-фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, которая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента - никотинамид-адениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов).

         Раскручивание двойной спирали и пространственное разделение цепей осуществляется при помощи нескольких специальных белков. Так называемые геликазы расплетают короткие участки ДНК, находящиеся непосредственно перед репликационной вилкой. На разделение каждой пары оснований расходуется энергия гидролиза двух молекул АТФ до аденозиндифосфата и фосфата. К каждой из разделившихся цепей присоединяется несколько молекул ДНК-связывающих белков, которые препятствуют образованию комплементарных пар и обратному воссоединению цепей. Благодаря этому нуклеотидные последовательности цепей ДНК оказываются доступными для репликативной системы. Другие специфические белки помогают праймазе получить доступ к матрице отстающей цепи. В результате праймаза связывается с ДНК и синтезирует РНК-затравки для фрагментов отстающей цепи. Для формирования новых спиралей не требуется ни затрат энергии, ни участия какого-либо "закручивающего" фермента.

         В случае кольцевого репликона (например у плазмиды) описанный процесс называется q-репликацией. Так как кольцевые молекулы ДНК закручены сами на себя (суперспирализованы), при раскручивании двойной спирали в процессе репликации они должны непрерывно вращаться вокруг собственной оси. При этом возникает торсионное напряжение, которое устраняется путем разрыва одной из цепей. Затем оба конца сразу же вновь соединяются друг с другом. Эту функцию выполняет фермент ДНК-топоизомераза. Репликация в этом случае обычно происходит в двух направлениях, т.е. существуют две репликационные вилки (рис. 4). После завершения репликации появляются две двухцепочечные молекулы, которые сначала связаны друг с другом как звенья одной цепи. При их разделении одно из двух колец временно разрывается.

Рис. 4. Один из механизмов репликации плазмиды (начало репликации обозначено точками); направления движения репликационной вилки показаны стрелками, образующиеся новые цепи ДНК-пунктиром.

         Альтернативный вариант репликации кольцевого репликона предполагает разрыв в одной из цепей двухспиральной молекулы ДНК. Образовавшийся при этом свободный 3'-конец ковалентно наращивается, оставаясь связанным с матрицей (второй, неразорванной цепью), а 5'-конец постепенно вытесняется новой полинуклеотидной цепью (рис. 5). Таким образом одна цепь разматывается и непрерывно удлиняется, а репликационная вилка скользит вокруг кольцевой матричной цепи (механизм "катящегося кольца"). По мере роста новой цепи вытесненная цепь с освободившимся 5'-концом становится линейной матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Этот синтез на линейной матрице продолжается до тех пор, пока не образуется дочерняя цепь ДНК, комплементарная одному обороту кольцевой матрицы, т. е. целому репликону. Таким путем с кольцевой матрицы может сходить большое число комплементарных копий. Такой механизм обнаружен у некоторыхрых вирусов, а также в ряде клеток эукариот.

Рис. 5. Схема репликации по механизму катящегося кольца (новая молекула ДНК показана пунктиром): 1-3'-конец ДНК; 2-5'-конец ДНК.

         Еще одна схема репликации предполагает формирование структуры, названной D-петлей. Согласно этому механизму, сначала реплицируется только одна из цепей кольцевого репликона, тогда как вторая цепь, оставаясь интактной, вытесняется, образуя петлю. Репликация второй цепи начинается с другой стартовой точки и только после того, как реплицировалась часть первой цепи. Такой механизм репликации обнаружен, например, у митохондриальных ДНК.

         Репликация РНК (синтез РНК на РНК-матрице) изучена меньше. Она осуществляется только у некоторых вирусов (например, у вирусов полиомиелита и бешенства). Фермент, катализирующий этот процесс, РНК-зависимая РНК-полимераза (его называют также РНК-репликазой или РНК-синтетазой). Известно несколько типов репликации РНК: 1) вирусы, содержащие матричные РНК, или мРНК [так называемые (+)РНК], в результате репликации образуют комплементарную ей цепь [(-)РНК], не являющуюся мРНК, которая используется как матрица для синтеза (+)РНК; 2) вирусы, содержащие (—)РНК, в результате репликации синтезируют (+)РНК; 3) вирусы, содержащие двухцепочечную РНК [(+)PHK и (—)РНК], в результате асимметрической репликации синтезируют (+)РНК.

Рекомбинантные ДНК и генетически модифицированные продукты.

         Стремление на протяжении человеческой истории к повышению пищевой ценности и безопасности пищи, обеспечению доступности продовольствия реализовывалось через совершенствование селекции растений и сельскохозяйственных животных, выращивания, уборки и хранения сельскохозяйственной продукции, а также способов переработки и хранения готовых пищевых продуктов. Применяемые подходы к улучшению качества и доступности пищевых продуктов привели к изменению генетики и физиологии организмов, используемых для производства продовольствия. Путем селекционного выведения растений и животных или отбора лучших штаммов микроорганизмов (бактерий, грибов) или путем целенаправленного введения мутаций, дающих желаемые свойства источников продовольствия, была коренным образом изменена организация генома этих организмов. Традиционные программы селекции сельскохозяйственных культур позволили добиться высоких результатов в умножении и усилении положительных свойств родственных растений. Однако продолжать повышение урожайности такими методами в настоящее время стало невозможно. Другой огромной проблемой является непредсказуемый и неконтролируемый характер болезней сельскохозяйственных культур.

         Начавшееся сравнительно недавно использование в производстве пищевых продуктов методов, которые объединяются общим термином «генетическая модификация», или получение пищи из генетически модифицированных источников, привлекает к себе повышенное внимание и даже предвзятое отношение общественности. Методы генетической модификации позволяют изменить организацию генетического материала целенаправленно, быстро и уверенно, как это было невозможно при традиционных методах селекции. Однако цели генетической модификации и традиционных методов селекции одни и те же.

         Таким образом, генетическая модификация - это лишь одна из современных технологий производства пищевых продуктов. В настоящее время для пищевых целей рассматриваются только растительные генетически модифицированные источники пищи. Для производства пищевых продуктов никакие животные генетической модификации пока не подвергаются. Однако, понимая интенсивность исследований и быстроту получения научных данных, данное заявление может оказаться устаревшим сразу после выхода в свет этой книги.

         Термин «генетическая модификация» используется для обозначения процесса, посредством которого можно изменить организацию генетического материала, используя для этого метод рекомбинантных ДНК. Этот процесс включает использование лабораторных методов введения, изменения или вырезания участков ДНК, содержащих один или более генов. Отличие генетической модификации от обычных методов скрещивания заключается в возможности манипулировать отдельными генами и переносить гены между разными видами растений, животных и микроорганизмов, которые не поддаются скрещиванию.

         Первые трансгенные растения были выведены в 1984 г. К 2000 г. генетической модификации подверглись около 100 видов растений. Однако сельскохозяйственное значение имеют в настоящее время лишь 8-10 культур. Несколько видов растений модифицированы с целью изменения состава и пищевой ценности, однако в настоящее время такие культуры не разрешены к сельскохозяйственному производству и получению пищевых продуктов. Большинство генетически модифицированных культур первого поколения (выращиваемые в производственных объемах) представляют собой культуры, модифицированные с целью только повышения урожайности, облегчения процесса уборки и переработки, лучшей сохранности или комбинации этих качеств. Это достигается путем придания устойчивости к болезням, вызываемым вирусами, бактериями, грибами, устойчивости к насекомым или к действию гербицидов. Немаловажным стимулом к созданию генетически модифицированных культур является снижение вынужденного применения инсектицидов и других пестицидов с широким спектром действия.

         Для выведения растений, защищенных путем генетической модификации от вредных насекомых, применяется несколько методов. Наиболее распространен метод включения и экспрессии генов, полученных из почвенной бактерии Bacillus thuringientis (Bt). Эти бактерии вырабатывают во время спорообразования кристаллы белка (дельта-эндотоксин), обладающего инсектицидным действием. Препараты из спор бактерий или выделенного белка на протяжении многих лет используются в качестве инсектицидов. В сельскохозяйственных культурах, генетически модифицированных с целью экспрессии токсинов В1, защита от насекомых осуществляется с помощью того же механизма. Токсины вырабатываются в неактивной форме, которая активируется кишечными протеиназами насекомого. Токсин прикрепляется к рецепторам в кишке и повреждает ее.

         У млекопитающих, в том числе и у человека, таких рецепторов нет. Поэтому токсины В1 обладают избирательной токсичностью для насекомых и нетоксичны для млекопитающих.

         Другие гены-инсектициды, которые используются при выведении генетически модифицированных культур, кодируют растительные лектины, ингибиторы пищеварительных ферментов организмов-вредителей (протеаз и амилаз), или участвуют в биосинтезе вторичных метаболитов растений.

         Генетически модифицированные растения, устойчивые к гербицидам, были получены путем введения в растения гена, выделенного из одного из почвенных микроорганизмов.

         Для повышения вирусоустойчивости генетическая модификация позволяет применить другой подход - «иммунизацию». Созданы генетически модифицированные вирусоустойчивые культуры, у которых растения с экспрессией генов, кодирующих определенные вирусные белки, приобретают иммунитет к последующей инфекции патогенным вирусом.

         Большинство выведенных в настоящее время методами генетической модификации сельскохозяйственных культур обладает более высокими сельскохозяйственными характеристиками. В перспективе развития технологии генетической модификации - создание пищевых продуктов с заданной или улучшенной пищевой ценностью. Пока пищевые продукты с измененной пищевой ценностью, созданные методами генетической модификации, на рынке отсутствуют. Однако экспериментальные образцы уже существуют и их приход в питание человека весьма вероятен. На это ориентируют уже имеющиеся примеры получения новых сортов сельскохозяйственных растений с измененными пищевыми свойствами методами традиционной селекции: рапса с низким уровнем эруковой кислоты, подсолнечника с высоким содержанием линолевой кислоты.

Биологические особенности и безопасность генетически модифицированных источников пищи.

         Пищевые продукты, получаемые из видов, выведенных традиционными методами селекции, употребляются в пищу сотни лет, и продолжают появляться новые виды. Сорта, обладающие по сути такими же свойствами, выводятся и методами генетической модификации путем переноса одного или нескольких генов. Принято считать, что обычные методы выведения новых сортов культур более безопасны, чем технология генной модификации.

         Анализ путей и механизмов, посредством которых в пищу могут попадать или в ней образоваться потенциально опасные для здоровья факторы, показывает, что пищевые продукты, полученные методами генетической модификации, по своей природе не представляют какого-то уникального риска. Изменения изначально присущих пищевых характеристик, показателей токсичности, аллергенности пищевых продуктов могут произойти вследствие изменений в экспрессии генов независимо от того, вызваны они традиционными методами селекции или же методами генетической модификации. Тем менее, в настоящее время в странах ЕС продукты, полученные методами генетической модификации, подвергаются более жесткой оценке и пристальному изучению, чем продукты, полученные другими способами. Это происходит не потому, что такие продукты создают больший риск, а лишь в качестве меры предосторожности, пока не будет приобретен опыт использования этой технологии.