Технології одержання і комплексне експериментальне дослідження антимікробних срібловмісних нанопокриттів мікроімплантатів

МІНІСТЕРСТВО  ОСВІТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ  ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ

«КИЇВСЬКИЙ  ПОЛІТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Доповідь

по дисципліні «Нанотехнології в медицині»

 

на тему: «Технології одержання і комплексне експериментальне дослідження антимікробних срібловмісних нанопокриттів

мікроімплантатів»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Група ПБ-82(м)

Студентка Печена М. Р.

Викладач: доцент Терещенко  М.Ф.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Київ 2013

В останні роки в медичній практиці все ширше  використовуються імплантаційних конструкції з нанесенням на поверхню різних сполучень і металів [1-8]. Можливості нанотехнології значно зросли після впровадження в медицину спеціальних методик з отримання нанодісперсій металів, зокрема срібла, міді та інших [5].

Спільними зусиллями з  фізиками були розроблені способи синтезу дисперсій наночастинок срібла, міді, золота, причому ці препарати вже випускаються за технічними умовами ТУ 2499-023-74107096-2007. Отримані дисперсії практично не містять катіонів срібла і не дратують слизової оболонки [6].

Унікальні властивості колоїдних нанодисперсій срібла в комплексі з міддю і золотом, а саме властивості природного антисептика щодо багатьох видів бактерій і вірусів, при цьому практично не токсичного, в сукупності з відсутністю резистентності мікроорганізмів до нього і безпекою застосування для людини, можуть зробити ці продукти незамінними для профілактики і боротьби з інфекції при використанні іригацій, інгаляцій, аплікацій , компресів і т.д. [5].

Срібло має неспецифічну антисептичну дію по відношенню до ряду вірусів, бактерій, грибів, плісняви​​. Воно є природним антисептиком з низькою токсичністю і відсутністю алергічного дії на людський організм. Препарати, що містять іони срібла, використовуються в медицині для лікування деяких важковиліковних шкірних захворювань, обробки слизових оболонок, ран, виразок. Косметична промисловість виробляє креми, зубні пасти, які містять іони срібла. У побуті використовуються пральні машини, які знезаражують білизна, подаючи в миючий розчин іони срібла.

Біоцидну дію препаратів на основі наночасток срібла та його сумішей з іншими металами може послаблюватися чи видозмінюватися в присутності аніонів, що утворюють нерозчинні, неактивні солі з катіонами металів (або розчинами, але не володіють біоцидними властивостями комплекси металів), наприклад, при тривалому впливі розчинів хлориду натрію. Встановлено, що протягом декількох годин концентрат срібла і його розчини стабільні в присутності аніонів (0,9% розчин NаСl) у зв'язку з практичною відсутністю в концентраті вільних катіонів срібла. Нанопрепаратів зі срібла, золота, міді не викликають алергічних реакцій і в рекомендованих кількостях безпечні для людини.

Наночастки срібла є своєрідною депонованою формою іонів срібла, які постійно генеруються і елімінуються з поверхні по мірі їх зв'язування з біологічними субстратами. При цьому локально (поблизу поверхні) створюються досить великі концентрації іонів, згубні для мікробів, але нешкідливі для мікроорганізму в цілому, оскільки розмір мікро-організмів зіставимо з розмірами кластерних і колоїдних наночастинок срібла. А це забезпечить більш м'яку пролонговану дію нанопрепаратів. Біологічна дія наночасток срібла може бути обумовлена також їх каталітичними властивостями. Каталізатор – це речовина, що змінює швидкість хімічної реакції або викликає її, але не входить до складу продукту. Концентрації срібла, летальні для мікробів, нешкідливі для людини, що значно підвищує цінність нанопрепаратів срібла.

З сучасних позицій нормальну  мікрофлору розглядають як сукупність безлічі мікро-біоценозів, що характеризуються певним складом і займають той чи інший біотип в організмі людини. У будь-якому мікробіоценозі розрізняють види, що постійно зустрічаються або характерні види (автохтонна флора) і додаткові або випадкові види (транзиторна, алохтонна флора). Кількість характерних видів відносно невелика, зате чисельно вони представлені завжди найбільш рясно.

У порожнині  рота зустрічається більше 300 видів  мікробів. Їх кількість в слині досягає 10⁹ колоніоутворюючих одиниць (КУО) на 1 мл, а співвідношення анаеробів і аеробів складає 10:1. У зіскрібках з ясен концентрація бактерій може скласти 10¹² КУО на 1 мл, при цьому вказане співвідношення зсувається і стає 1000:1. Функції нормальної мікрофлори людини різноманітні, і однією з найважливіших є участь її в кооперації з організмом господаря і забезпеченні колонізаційної резистентності, під якою мається на увазі сукупність механізмів, що додають стабільність нормальній мікрофлорі і забезпечують запобігання-обертання заселення організму господаря сторонніми мікроорганізмами. У разі зниження колонізаційної резистентності відбувається збільшення числа і спектру потенційно патогенних мікроор-ганізмів. Виступаючи в якості «природного біо-сорбента» нормальна мікрофлора здатна акумулювати потрапляючі ззовні або ті, що утворюються в організмі господаря токсичні продукти, включаючи метали, феноли та інші ксенобіотики. Нормальна мікрофлора, мабуть, той неспецифічний бар'єр, лише після прориву якого ініціюється включення неспецифічних і специфічних механізмів захисту. Говорячи про нормальну мікрофлору, слід мати на увазі, що її представники, за певних умов, можуть виступати і як фактори агресії.

Дослідження останніх років дозволили по-іншому трактувати значення нормальної мікрофлори для  організму людини і особливо оцінку ролі умовно-патогенних мікроорганізмів. Належність зазначених умовно-патогенних мікроорганізмів (УПМ) до природної мікрофлори організму або зовнішнього середовища визначає основну особливість мікробіологічних досліджень викликаючих ними хвороб.

Для оцінки бактеріостатичної або бактерицидної дії нанопрепаратів срібла в ротовій порожнині необхідно враховувати весь комплекс мікроорганізмів, які у нормі населяють порожнину рота, наліт на зубах, вміст ясенних кишень, і особливу увагу приділити колонієутворюючим одиницям як патогенних, так і умовно-патогенних мікроорганізмів. Тому при проведенні експериментів з імплантатами була спеціально відпрацювана «інфікуюча доза», здатна витримати дію нанопрепаратів срібла, або, навпаки, після термостатування в контакті з нанопрепаратами бактерії гинули. Важливо було враховувати і ті обставини, щоб концентрація наночасток срібла не впливала на нормальну мікрофлору.

Подібний підхід був вперше застосований для модифікації поверхні ортодонтичних мікро-імплантатів [9].

Для проведення досліджень використовувались моделі ортодонтичних мікроімплантів, приготованих за спеціальною технологією з титану марки

ВТ1-00 з композиційним  наностуктурованим срібловміснии покриттям на ос-нові гідроксиапатиту, і експериментально була вивчена можливість створення «заданої» концентрації мікроорганізмів на імплантаті з модифікованою поверхнею. Композиційне покриття було отримане з використанням технологій електроплазменного напилення, ультразвукового впливу в процесі підготовки поверхні імплантату під напилення, під час і після нанесення покриття. Подібна комбінована технологія дозволяє отримувати покриття із заданими характеристиками, а саме адгезіонно-когезіонними показниками, пористістю і швидкістю вивільнення препаратів срібла з пористого каркаса покриття (рис. 1) [10]. Основними структурними елементами покриття є твердий каркас, утворений з напилених частинок, і макропор, тобто порожнечі, утворені внаслідок нещільної упаковки твердих частинок в процесі напилення. Важливими елементами структури покриття є нанопори, які утворюються в основному внаслідок особливостей кристалізації матеріалу частинок каркаса, зокрема дендритного характеру кристалізації.

Рис.1. Схема композиційного наностуктурованого покриття мікроімплантатів:

1 – матеріал мікроімплантатів; 2 – пористе покриття; 3 – перехідний шар між живою тканиною і покриттям; 4 – жива тканина

 

Каркас покриття, структурований нанопорами, являє собою фільтр, який попередньо, перед установкою імплантата в організм, насичується

3-5%-вим розчином повіаргола [11, 12]. Після установки мікроімплантатів лікарська речовина буде повільно протягом прогнозованого часу надходити в зону контакту живої тканини з матеріалом імплантованої конструкції. При цьому макропори є ємністю для довгострокового зберігання лікарської речовини, а нанопори забезпечують прогнозовану тривалість потрапляння лікарської речовини в зону контакту живої тканини з поверхнею імплантату (рис. 2).

Рис. 2. Схематичне зображення пор, присутніх в композиційному покритті мікроімплантатів:

1 – нанопори; 2 – макропори; 3 – каркас покриття

 

Для отримання  та дослідження покриттів мікро-імплантатів  використовувалися установка плазмового напилення типу ГРЕС, ультразвукова ванна ПБС-ГАЛС, електронні ваги Scout (SPU202), експериментальна електрохімічна комірка, ультразвуковий генератор УГТ-901, апарат абразивно-струменевої обробки «Чайка-20», атомно-силовий мультимікроскоп СММ-2000, комп'ютерний аналізатор зображень мікроструктур АГПМ-6М та ін.. Особливістю пропонованої комбінованої технології отримання бактерицидних покриттів являється використання при підготовці поверхні перед напиленням ультразвукової повітряно-абразивної обробки на режимах, які виключають розмірну ерозію (надлишковий тиск 0,65 МПа, амплітуда УЗ 8-10 мкм, час обробки 30-40 с), введення додаткової операції УЗ хімічного травлення цієї поверхні з метою отримання рівномірного рельєфу при збільшеній шорсткості в розчині 2М HNО₃ +1M HF протягом 5 хвилин з інтенсивністю УЗ 9,6 Вт/см₂. Рекомендовані режими плазмового напилення покриттів різного складу наведені в таблиці 1 [12].

Компоненти, що містять срібло вводяться до складу покриття як в процесі електроплазменного напилення (з використанням срібновмісткого гідроксиапатиту) [13], так і по завершенні процесу напилення в пористий каркас готового покриття. Використовуються наступні режими фінішної обробки композиційних покриттів в ультразвуковому полі: амплітуда ультразвукових коливань випромінювача 15...20 мкм при резонансній частоті 22 кГц; частота обертання мікроіплантатів 10…20 об / хв, швидкість їх зворотно-поступального обертання щодо випромінювача 30…40 мм / хв.

 

Таблиця 1. Режими плазмового напилення композиційних покриттів

Технологічний параметр	Одиниці вимірювання	Значення
		при напиленні  титану	при напиленні ГА
Струм плазменної дуги	А	350	540
Дистанція напилення	Мм	105-110	100
Дисперсність порошку	Мкм	40-60	20-30
Время напыления	Мин	0,35	0,13

Деталі поміщаються  в розчин, який містить срібло (повіаргол) на відстані 5…10 мм від торця випромінювача. Час обробки залежить від концентрації робочого розчину і бажаної бактерицидної активності покриття. Для здійснення даного процесу створена спеціальна установка з системою фокусування ультразвукового поля [13, 14].

При проведенні мікробіологічних досліджень срібловмісних  композиційних покриттів, використовувались штами бактерій з Міжнародної колекції типових культур – еталонні штами: S.aureus ATCC 25923, S.epidermidis ATTC 14990, S.saprophiticus ATCC 15305, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Streptococcus salivarius ATCC 13419, S . agalactae ATCC 13813, S.pyogenes ATCC 1961, E.coli ATCC 25922 і Ps.aeruginosa ATCC 10145. Типові культури використовувалися з метою виявити, який вплив на бактерії дає нанопрепарат, що міститься на імплантаті і в ротовій порожнині.

Для вивчення культуральних  і морфологічних властивостей мікроорганізмів використовувалися 24-нні культури. Посівний матеріал засівали на щільні і рідкі поживні середовища, в яких заранше в стерильних умовах поміщали імплантати. На щільному поживному середовищі (чашка Петрі) посіви виробляли шпателем з розсіюванням по всій поверхні чашки. В глибині живильного середовища на дні чашки Петрі поміщали імплантати. Універсальним середовищем загального призначення при висіві будь-якого біоматеріалу є кров'яний агар, основою якого були різні за складом, але повноцінні по спектру поживних компонентів середовища. На цих середовищах додатково вивчалися і гемолітичні властивості мікроорганізмів [3]. Вивчення характеру вирослих на кров'яному агарі колоній і обговорення результатів давали можливість провести первинну ідентифікацію культур і визначити необхідні тести для порівняння культур до і після впливу нанопрепаратів. Початкові дослідження культурних властивостей дозволяли оцінити ступінь впливу шкідливого агента на мікробну клітину, з'ясувати степінь поразки або взагалі індиферентність нанопрепарату.

При вивченні впливу препаратів срібла та інших матеріалів користовувались традиційні методи ідентифікації бактерій, в першу чергу біохімічні тести. Вивчали лише свіжі 18-24-годинні культури. На початковому етапі ідентифікацію у всіх бактерій визначали оксидазу, для чого наносили 1 краплю реагенту безпосередньо на досліджувану колонію до появи темно-фіолетового забарвлення. Найчастіше використовували непрямий спосіб на фільтрованому папері: смужку з фільтрованого паперу змочують 1-2 краплями реактиву, стерильною петлею переносять досліджувану колонію і розмазують на смужці, і при позитивній реакції через 10-30 секунд з'являється фарбування інтенсивного фіолетового кольору. При негативній реакції колір не змінюється.