Станция "Аномальное рассеяние" в Новосибирске

      Активное  практическое применение методов аномальной дифракции в рентгеноструктурном  анализе началось с появлением источников СИ второго поколения, дающих яркое  настраиваемое по энергии рентгеновское  излучение. Атомная селективность  аномального рассеяния и его  чувствительность к состоянию окисления  катионов нашла широкое применение во время бума с исследованием  структур оксидных высокотемпературных  сверхпроводников в конце 1980-х годов. Вторым наиболее известным практическим применением методов аномальной дифракции, получившим самое широкое  распространение, стало экспериментальное  определение фаз структурных  факторов при расшифровке структуры  белков и биологических кристаллов. Аномальная дифракция позволила  в значительной степени отказаться от трудно реализуемого метода изоморфного  замещения, который раньше был практически  единственным способом рентгеноструктурного анализа белков. Сегодня сильнейшими  стимулами для развития теории и  методов рентгеновской кристаллографии  с применением аномального рассеяния  являются главным образом два  научно-технологических направления  — это исследование генома человека и связанная с ним необходимость  расшифровки структуры сложных  белков, а также бурно развивающаяся  разработка новых катализаторов, для  которой требуется знать состояние  и поведение определенных химических элементов в структуре катализатора. 
 

  Многоволновая аномальная дифракция (МАД)

     Долгое  время в рентгеновской кристаллографии  белков, очень сложная структура  которых состоит в основном из легких атомов, практически единственным способом определения фаз структурных  факторов был метод мультиплетного изоморфного замещения (МИЗ, известный  в англоязычной литературе как метод MIR = multiplet isomorphous replacement), основанный на введении в состав белка тяжелых  атомов, которые служат началами отсчета  для определения фаз. Этот метод  состоит в получении набора дифракционных  данных от исследуемого нативного белка  и нескольких его измоморфных  производных — невалентных комплексов белка с тяжелыми атомами (Аи, Pb, Hg, Ag, Т1 и др.), присоединение которых  не должно искажать пространственное расположение других атомов в белковой молекуле и изменять элементарную ячейку кристалла белка. По наборам данных от изоморфных производных исследуемого белка, как правило, удается определить положение тяжелых атомов, а по сравнению интенсивностей рефлексов  от этих образцов и от кристалла  нативного белка удается определить фазы структурных факторов, необходимые  для расшифровки полной структуры. Метод МИЗ для расшифровки  структуры белков был разработан и испытан в середине 1950-х годов  и до начала 1990-х годов оставался  монопольным способом решения фазовой  проблемы при расшифровке структуры  белков. Несмотря на свою эффективность, метод МИЗ имеет ряд недостатков, ограничивающих область его применения: во-первых, необходимость приготовления  образцов изоморфных производных, что  является очень длительным и не всегда успешным процессом, а, во-вторых, в  нем используется сравнение данных, полученных на разных образцах, каждый из которых может иметь свои особенности, делающие такое сравнение не совсем корректным.

     Сегодня можно с уверенностью говорить, что  указанные недостатки рентгеноструктурного анализа белков уже удалось устранить  с помощью синхротронного излучения, которое позволяет при дифракционных измерениях настраиваться на любую нужную длину волны рентгеновского диапазона и использовать для определения фаз эффект аномального рассеяния атомами, естественным образом содержащимися в структуре молекул белков. Метод многоволновой аномальной дифракции (MAD), пришедший на подмогу методу МИЗ в рентгеноструктурном анализе белков, основан на использовании эффекта аномального рассеяния какого-либо из атомов содержащихся в составе белка. Все необходимые измерения проводятся на одном монокристалле, содержащем атомы с достаточно сильным аномальным рассеянием в области скачка поглощения. Для определения фаз и полной расшифровки структуры в этом методе требуется иметь минимум две длины волны (λ1 и λ2) рентгеновского излучения и три набора дифракционных данных, в которых должны присутствовать фриделевские пары , и , а еще лучше . Присутствие атома металла в структуре белка не является проблемой, поскольку около 30% белков являются металлопротеинами, и эти атомы могут быть использованы в качестве аномально рассеивающих центров. В случае отсутствия подобной метки возможно приготовление образца белка с подстановкой селенометанина и использование края поглощения селена для аномальной дифракции.

     Для того, чтобы МАД стала рутинным методом исследования макромолекуляр-ных  кристаллов, кроме наличия настраиваемого по длине волны синхротронного излучения  пришлось решить целый ряд сложных  технических проблем. За последние  два десятка лет была создана  прикладная теория метода, созданы  измерительные установки, удовлетворяющие  специальным требованиям эксперимента для решения структур методом  МАД, и разработаны компьютерные программы для выделения фаз  из дифракционных данных, испытывающих эффект аномального рассеяния. Расширению области применений метода также  способствовало развитие методов замораживания  белковых кристаллов до температуры  жидкого азота, что позволило повысить точность дифракционных измерений и продлить срок жизни кристаллов.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Экспериментальные станции для аномальной дифракции на СИ

     Сбор  дифракционных данных для метода МАД практически сходен с обычным  монокристальным дифракционным  экспериментом, но определение фаз  по эффекту аномального рассеяния  накладывает особо строгие требования на измерительные установки (рентгеновские  синхротронные дифрактометры или  экспериментальные станции на пучках СИ), в частности на точность измерения  интенсивности рефлексов, стабильность синхротронного излучения и на разрешающую  способность используемых для отбора излучения монохроматоров. Причиной суровых требований к точности экспериментальных  данных, пригодных для решения  фазовой проблемы методом МАД, связана  с необходимостью сравнивать несколько  наборов данных от одного образца. При  этом разность в интенсивности рефлексов (или величин экспериментальных  структурных амплитуд), обусловленная  аномальным рассеянием, слабо превосходит  ошибки измерения. Чтобы удовлетворить  эти жесткие требования на ряде источников СИ были выделены пучки и созданы  экспериментальные станции, специально предназначенные для структурных  исследований методом МАД. Примерами  являются пучки: Х4А ис1 Х12С на накопительном  кольце NSLS; 17-ВМ, 19-ВМ и 19-ID на APS; F2 на CHESS; 1-5 на SSRL; 9,5 и MAD-10 на SRS; ВМ14 и ID29 на ESRF. Особенно эффективны для МАД оказались  пучки излучения из вставных магнитных  устройств (ондуляторов) в источниках СИ 3-го поколения, например, на APS, SPring-8 (Japan) и ESRF (см. Ogata, 1998). Яркость и стабильность излучения из ондуляторов оказалась  намного выше, чем излучение из поворотных магнитов, кроме того ондуляторное излучение характеризуется специфической  и управляемой поляризацией, что  важно при работе с чувствительным к поляризации аномальным рассеянием, поэтому пучки из ондуляторов  лучше всего подходят для экспериментов  с аномальной дифракцией.

     Большинство экспериментов с аномальным рассеянием относятся к области рентгеновской  дифрактометрии для структурного анализа. Поэтому экспериментальные станции для подобных исследований на СИ имеют рентгеновские дифрактометры, подобные тем, которые используются в станциях для рентгеновской дифрактометрии порошков и монокристаллов. В принципе, эксперименты с аномальной дифракцией можно проводить прямо на этих обычных дифрактометрах, если на них установить дополнительный детектор с высоким спектральным разрешением для измерения флуоресцентного излучения образца, и если рентгеновские оптические системы каналов СИ, на которых работают эти станции, способны обеспечить необходимую степень монохроматичности излучения при достаточно высокой интенсивности пучка рентгеновских лучей, быструю точную настройку на нужную длину волны и стабильное удержание этих параметров в течение всего эксперимента. В этом примере ширина области скачка поглощения составляет около 5 эВ. Чтобы провести хотя бы два отличающихся друг от друга измерения на этом участке, рентгенооптическая система пучка СИ должна обеспечивать монохроматичность отбираемой линии излучения . Для выполнения такого жесткого условия лучше всего подходит рентгенооптическая схема обычно применяемая при исследованиях тонкой структуры спектров поглощения.

     Рентгенооптическая  система и тип источника СИ (поворотный магнит или вставное магнитное  устройство) являются критическими параметрами  для создания экспериментальных  станций рентгеноструктурного анализа  методами аномальной дифракции. Сигнал аномального рассеяния слаб по сравнению  с суммарной интенсивностью брэгговского отражения даже монокристаллического образца (изменение интенсивности  из-за аномального рассеяния обычно 2-6%, см. например, Walsh et al., 1999), поэтому  для его надежного и точного  измерения необходимо набирать большую  статистику при регистрации брэгговских  рефлексов. Чтобы длительность измерений  не была слишком большой, требуются  пучки рентгеновских лучей с  высокой плотностью потока фотонов  в месте положения образца. Для  получения столь высоких потоков в спектральной полосе 0,01 %ϵ  приходится применять сильную фокусировку пучка СИ. В последнее время с появлением коротких вакуумных ондуляторов с регулируемым магнитным зазором при строительстве станций для аномальной дифракции предпочтение отдается источникам этого типа, излучение которых сильно коллимировано и в вертикальном, и в горизонтальном направлениях, и которые имеют более высокую яркость, чем источники СИ из поворотных магнитов. 

     Дополнительным  достоинством этих источников является их способность регулировать энергию  выдаваемого излучения изменением величины магнитного зазора, что оказывается  хорошим подспорьем для рентгенооптической системы, позволяющим снизить технические  требования к ее конструкции, и облегчает  управление длиной волны рентгеновских  лучей в зоне образца. Тем не менее, рентгенооптические системы пучков СИ, на которых проводятся эксперименты с аномальной дифракцией, более сложны и прецизионны по сравнению с  теми, которыми можно пользоваться в обычной рентгеновской дифрактометрии.

     Большинство существующих сегодня на источниках СИ пучков для рентгеновской дифрактометрии с использованием аномального рассеяния  работает на кристаллографию белков. Для исследования с использованием резонансно рассеивающих меток, присутствующих в этих материалах, обычно хватает  энергетического диапазона от 5 до 20 кэВ, хотя в последнее время  есть тенденция к применению и  более длинноволнового излучения (вплоть до 1 кэВ, см. например, обзоры Helliwell, 2002; Helliwell, 2004), позволяющего использовать в качестве аномальных меток скачки поглощения атомов серы или фосфора  и усиливающего сигнал от легких атомов, из которых главным образом состоят  белки. Коллимация и фокусировка  излучения, отбираемого из спектра  СИ для аномальной дифракции, обычно осуществляется рентгеновским зеркалами, которые одновременно служат фильтрами  высших гармоник, а отбор необходимой  длины волны — двухкристальными монохроматорами с совершенными кристаллами. Использование в рентгенооптической системе двух зеркал дает дополнительную выгоду, состоящую в возможности с высокой точностью регулировать положение пучка в горизонтальном и вертикальном направлении путем наклона зеркал вокруг горизонтальной оси, а также наклоном этих осей, причем это можно делать независимо от длины волны (Ferrer et al., 1998).

     Спектральная  чистота и высокая степень  монохроматичности первичного пучка  рентгеновских лучей крайне важны  для успеха экспериментов с аномальным рассеянием.  Монохроматизация и  регулировка длины волны излучения  производится двухкристальным монохроматором, который часто выполняет еще  и дополнительную фокусировку пучка  в горизонтальном направлении. Обычно в таких монохроматорах используют пары совершенных кристаллов кремния  либо Si(lll), либо Si(311). Последний из них  обладает почти вдвое более, высоким  естественным энергетическим разрешением, а первый более высокой светосилой. Эффективность разных кристаллов различна для длинных и коротких волн, поэтому, если на рабочей станции требуется  использовать самые разные длины  волн из широкого диапазона  для  исследования краев поглощения разных атомов периодической системы, встречающихся  в образцах, то неизбежно придется менять кристаллы монохроматора, выбирая  наиболее эффективные для решения  конкретной задачи. В этих случаях  целесообразно применять монохроматоры  с разделенными кристаллами, обеспечивающие широкий диапазон регулировки длин волн и фиксированное положение  пучка выдаваемого излучения. Дополнительная регулировка ширины полосы монохроматического излучения может выполняться  еще и с помощью коллимирующих  щелей рентгенооптического блока.

     Универсальные рабочие станции для аномальной дифракции в очень широком  диапазоне энергий являются большой  редкостью на действующих сегодня  источниках СИ из-за высокой сложности  и стоимости подобных установок. Чаще станции аномальной дифракции  строятся для решения каких либо специальных исследований и работают в сильно ограниченной области длин волн. Сегодня существует довольно большое число специализированных рабочих станций, на которых практически серийно проводится решение одних и тех же задач, например, расшифровка кристаллов белков методами двухволновой или многоволновой аномальной дифракции (MAD), в которых резонансной меткой служат атомы селена. В таких случаях не требуется столь широкого диапазона, а достаточно иметь главную длину волны вблизи края  поглощения этого атома и полосу порядка ±1000 эВ около нее, поэтому на таких экспериментальных станциях можно применять более простые и дешевые монохроматоры с прорезным каналом, хотя они и не обеспечивают сохранение положения пучка при изменении длины волны, в результате чего приходится усложнять регулировки положений самой измерительной установки.

     Из  опыта работы с методами аномальной дифракции стало очевидно, что  практически все эти исследования нуждаются в знании вида абсорбционного спектра в области скачка поглощения аномально рассеивающего атома, т.е. дифракционному эксперименту должно предшествовать экспериментальное  измерение тонкой структуры спектра  поглощения (XAFS) исследуемого образца  хотя бы в узкой энергетической области  около края поглощения. Долгое время  методы аномальной дифракции и методы XAFS развивались раздельно, хотя часто  применялись к одним и тем  же материалам и решали похожие структурные  задачи. Но специализированные экспериментальные  станции для рентгеноструктурных  исследований методами аномальной дифракции, созданные в последние годы стали  в одном приборе сочетать рентгеновский  дифрактометр и флуоресцентный абсорбционный  спектрометр, что резко повысило скорость проведения экспериментов  и увеличило надежность и точность получаемых результатов. 
 

  Станция аномальной дифракции  в Новосибирске

     Одна  из описанных выше станций, экспериментальная  станция «Аномальное Рассеяние» была создана в Сибирском центе  синхротронного и терагерцового  излучений (СЦСТИ).

     Станция «Аномальное Рассеяние» предназначена  для прецезионных исследований структуры  поликристаллических материалов методами рентгеновской дифрактометрии. На Рисунке 1 представлена схема станции «Аномальное  Рассеяние» , а на Рисунке 2 ее общий  вид.