Методы исследования биологических мембран

Обозначим количество липидов  в жидкой фазе через m_l, а количество липидов в твёрдой фазе через m_s. Тогда доля жидких липидов будет равна

 (2)

На рис. 3. приведена кривая плавления дистеароил-фосфатидил холина (или дипальмитоил-лецитина, ДПЛ).

Методы измерения кривых плавления

Для определения  доли жидкой фазы в общем объёме изучаемого материала, в нашем случае, - в липидной слое мембран, можно использовать разные методы.

Анализ кривых ДСК

Один из них основан  на анализе кривых, полученных методом  дифференциальной сканирующей калориметрии. Обратимся снова к рисунку 2.

Пусть удельная теплота плавления  липида равна Q_m, а количество липодов в образце составляет m кмолей. Общее количество энергии, поглощённой образцом в интервале температур плавления T₁-T₂ равно очевидно площади под кривой C=f(T), т.е.

 (3)

В интервале температур от T₁ до текущей температуры T расплавится количество молей липида  m_д , и при этом поглотится количество тепла, равное

 (4)

(заштрихованная площадь  на рис.2).

При темпаратуре T молярная доля липидов, находящихся в жидкой фазе равна

 (5)

Таким образом, измеряя по отношению площадей под кривой C=f(T) при разных темпраратурах, мы строим кривую плавления =f(T).

 

 

                                       Ядерный магнитный резонанс.

Одна из основных особенностей живых организмов – огромное число  связей и взаимодействий как внутри них, так и с внешним миром. Видный советский биофизик М.В. Волькенштейн подчеркивал:“Живая природа, живые  организмы представляют собой многоуровневые сложные системы. Большие и малые  молекулы, клеточные органоиды, клетки, ткани, органы, организмы, популяции, биоценозы, биосфера...”. Он определял живой  организм “...как открытую, саморегулируемую, самовоспроизводящуюся и развивающуюся  гетерогенную систему...”.

Таким образом, живые организмы  – это, во-первых, открытые системы, которые обмениваются с внешней  средой веществом и энергией. Во-вторых, это – неоднородные, гетерогенные структуры, на поддержание определенного  строения в которых необходимы энергетические затраты.

Магнитные моменты ядер “чувствуют”  поля ближайшего окружения и “передают” информацию о структуре исследуемых  веществ. Поэтому, спектры ЯМР, отражая  многокомпонентную структуру биологических  объектов, характеризуются сложным  строением.

Среди спектроскопических методов  ЯМР отличается тем, что наряду со структурной информацией об исследуемом  объекте, он позволяет получать динамические характеристики изучаемой системы: трансляционную и вращательную подвижность  ядер, атомов и молекул.

Следовательно, применение метода ЯМР в биологии позволяет  получить больше информации по сравнению  с другими методами.

Как показывает эксперимент, суспензии клеток представляют собой  простейшие гетерогенные системы: двухкомпонентную или трехкомпонентную с обменом (переносом) молекул веществ (ядерных  спинов) через клеточные мембраны. Модель двухкомпонентной системы ядерных  спинов с обменом намагниченности  между компонентами широко используется для интерпретации экспериментальных  данных при исследовании различных  физико-химических и биологических  систем, например, рабочее вещество ЯМР-магнитометров и тесламетров  с динамической поляризацией ядеp представляет собой бинарную систему ядерных  спинов.

Нами проведено моделирование  и детальное изучение свойств  двухкомпонентной системы, дано решение  обратной задачи ЯМР-релаксации – определение  параметров компонент по измеряемым в эксперименте параметрам: амплитудам и временам релаксации компонент  сигнала ЯМР. Показано, что при  изменении экспериментальных условий, например, температуры, возможен сдвиг  “рабочей точки”, т.е. происходит изменение  условий, в результате чего первоначальное приближение уже не работает. Игнорирование  этого обстоятельства при использовании  приближенных выражений приводит к  неверной интерпретации опытных  данных, которая, например, описана  в литературе при изучении температурной  зависимости переноса молекул воды через эритроцитарную мембрану, или  при исследовании энергии активации  диффузии воды.

Предложен метод определения  осмотических свойств клеточных  мембран – изменения внутриклеточного объема при одновременном контроле водной проницаемости мембраны.

Этим методом были исследованы  различные клетки (эритроциты, E. Coli, и т.д.) и выявлены особенности  осмотического поведения в зависимости  от строения клеточной стенки. Предложен  способ определения внутриклеточного осмотического давления.

Логическим продолжением данного метода стал предложенный нами способ исследования свойств мембран  клеток при замораживании.

При исследовании в зоне отрицательных температур изменяется ряд параметров: температура, концентрация раствора, ионная сила и т.д. Сюда же добавляется механическое действие льда.

В ходе криобиологических  экспериментов на клетки одновременно воздействует комплекс повреждающих факторов: происходит образование и рекристаллизация льда, изменяются температура, концентрация раствора, осмотические и ионные силы и т.д. Существующие способы исследования свойств клеток в области отрицательных  температур измеряют интегральное действие повреждающих факторов после всего  цикла замораживание-отогрев. Предложенный нами метод позволяет дифференцированно  определять действие повреждающих факторов и изменения их водной проницаемости  от различных физических факторов в  условиях льдообразования.

Согласно разработанному способу различают отдельно повреждения  мембран в результате: увеличения осмотического давления внеклеточной среды и воздействий кристаллами  льда, а также при рекристаллизации льда на этапе размораживания. Способ позволяет различать изменения  проницаемости мембран вследствие: изменения осмотического давления в цикле замораживание-отогрев, воздействия  кристаллами льда при замораживании, а также воздействия кристаллами  льда при замораживании-отогреве. Предложенным способом определяют изменение водной проницаемости в замороженном состоянии  в результате увеличения осмотического  давления внеклеточной среды, если в  процессе замораживания клетки не повреждаются.

Дифференцировка причин повреждений  клеток и изменений барьерных  свойств мембран в ходе эксперимента позволяют судить о динамике процессов, происходящих в зоне отрицательных  температур, выделять как повреждающие факторы, так и этап повреждения, на котором эти факторы воздействуют.

Проведено исследование терморезистентности (термоустойчивости) клеток. Показано,что  у жизнеспособных клеток в осмотически  активных средах возрастает устойчивость к нагреву.

При измерении кривой продольной намагниченности суспензия клеток должна рассматриваться уже как  трехкомпонентная система. Нами проведено  моделирование процессов в трехкомпонентной системе и показано согласие с  экспериментальными данными.  

 

 

 

Литература 

1. Скрыпин В.И., Волкова  Л.А., Рыжов В.Г., Сахаров Б.В., Волков  В.Я.

Исследование повреждений  модельных и биологических мембран  при замораживании-оттаивании радиоспектроскопическими методами. - Всесоюзный симпозиум “Магнитный резонанс в биологии и медицине”, Тезисы докладов, Звенигород, 1981. 

2. Исангалин Ф.Ш., Рыжов  В.Г., Волков В.Я. 

Изучение эффектов осмотического  сжатия клеток методом импульсного  ЯМР. - I Всесоюзный биофизический съезд, Тезисы докладов, Т.2, с.9, 1982.

3. Рыжов В.Г.

Применение метода ЯМР-релаксации для исследования реакции клеток на образование внеклеточного льда. - Вторая Всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии, Тезисы докладов, Т.1, с.892, Харьков, 1984. 

4. Гулевский А.К., Волкова  Л.А., Рыжов В.Г., Волков В.Я.

О температурном диапазоне  нарушения проницаемости плазматических мембран эритроцитов для катионов и воды при медленном замораживании. - Биофизика, N 3, 1984, с. 502, Полностью депон. В ВИНИТИ 29.02.1984 N 1150-84. 

5. Рыжов В.Г., Исангалин  Ф.Ш., Волков В.Я.

ЯМР-релаксация в двухфазной системе. Применение парамагнитных  ионов для определения осмотических свойств эритроцитарной мембраны. - Деп. ВНИИСЭНТИ Главмикробиопром, 1985, 42с. 

6. Рыжов В.Г., Исангалин  Ф.Ш., Волков В.Я.

Способ определения осмотических свойств клеточных мембран. (Методом  ЯМР). - А.С. N1224693, Приоритет от 06.07.84.

7. Рубин А.Б. Биофизика.  Книга 2. Биофизика клеточных процессов.  М.: Высшая школа, 1987.

8. Современные достижения  физики (в помощь школьнику). М.: Наука, 1990.

9. Ивков В.Г., Берестовский  Г.Н. Динамическая структура липидного  бислоя. М.: Наука, 1978.

10. Антонов В.Ф., Смирнова  Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны  при фазовых превращениях. М.: Наука, 1992.

12. Беркинблит М.Б., Глаголева  Е.Г. Электричество в живых  организмах. Библиотечка "Квант", вып. 69. М.: Наука, 1988.

13. Биофизика сложных систем  и радиационных нарушений. М.: Наука, 1977.

14. Ходжкин А. Нервный  импульс. М.: Мир, 1965.