Центрифугирование

Центрифугирование — разделение неоднородных систем (напр., жидкость — твердые частицы) на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Центрифугирование осуществляется в аппаратах, называемых центрифугами

Частицы в растворе осаждаются (седиментация), когда их плотность выше плотности раствора, или всплывают (флотация), когда их плотность ниже плотности раствора. Чем больше разница в плотности, тем быстрее идет распределение частиц. Когда плотности частиц и раствора одинаковые (изопикнические условия), частицы остаются неподвижными. При малой разнице в плотности частицы можно разделить только в центрифуге, которая создает центробежную силу, во много раз превышающую силу земного притяжения..

Принцип действия центрифуги основан на создании большой центробежной силы, под влиянием которой скорость разделения компонентов смеси, помещенной в центрифугу, увеличивается во много  раз по сравнению со скоростью  разделения их под действием силы тяжести.

В клинических и санитарно-гигиенических  лабораториях центрифугирование используют для отделения эритроцитов от плазмы крови, сгустков крови от сыворотки, плотных частиц от жидкой части мочи и т. д.

2.1 Дифференциальное центрифугирование

 

Этот метод основан на различиях  в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами  и плотностью. Разделяемый материал, например гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый осадок практически невозможно; чтобы понять, почему это происходит, обратимся к рассмотрению процесса, происходящего в центрифужной пробирке в начале каждой стадии центрифугирования.

Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно, поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность. На рис. 2.3 изображена схема фракционирования гомогената печени крысы.

Дифференциальное центрифугирование  является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных  органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но даже и в этом случае получаемые фракции никогда не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, описанные ниже. Эти методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивают более эффективное разделение благодаря тому, что центрифугирование осуществляют в растворах с непрерывным или ступенчатым градиентом плотности. Недостатком этих методов является то, что приходится тратить время на получение градиента плотности раствора.

2.2 Зонально-скоростное центрифугирование

 

Метод зонально-скоростного, или, как  его еще называют, s-зонального центрифугирования, заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК—ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.

 

 

2.3 Изопикническое центрифугирование

 

Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярный вес которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают, и образец суспендируют в среде, плотность которой такая же, как и у фракции, которую хотят выделить, а затем центрифугируют до тех пор, пока исследуемые частицы не осядут на дно пробирки, а частицы меньшей плотности не всплывут на поверхность жидкости..

Другой способ заключается в  наслаивании образца на поверхность  раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование  проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с  плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зонально-изопикнического, или резонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность, а не размеры или форма частиц.

2.4 Равновесное центрифугирование  в градиенте плотности

 

Для создания градиента плотности  используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а  также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. И растворенное вещество, и растворитель сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности CsCl, так как ионы цезия обладают большой массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей им плотностью. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК Е. coli. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеидов плазмы крови человека.

Отстаивание(Отстаивание представляет собой в широком смысле процесс разделения фаз различной плотности под действием гравитационного поля (силы тяжести), в частном случае отделение твердой фазы от жидкой.) в гравитационном поле является малоэффективным процессом, осуществляется в громоздкой аппаратуре, возможности его интенсификации ограничены.

Размеры частиц, взвешенных в масле, различны: более крупные  раньше других оседают на дно отстойника, более мелкие продолжают оставаться еще в верхних слоях осветляемого масла. При наличии очень тонкодисперсных  фракций среди взвешенных частиц пришлось бы долго ждать полного  осветления: в некоторых случаях  на это потребовались бы месяцы, если не годы.

Значительно эффективнее  происходит разделение фаз в центробежном поле, которое создается в аппаратах-центрифугах (сепараторах).

Из формулы Стокса следует, что можно увеличить скорость оседания частиц, поднимая значение величины ускорения g . Само собой разумеется, что, поскольку речь идет об ускорении силы тяжести, влиять как бы то ни было на эту величину не представляется возможным. Но, заменяя действие силы тяжести действием другой силы, мы можем получить любое другое ускорение. В этом отношении оказывается целесообразным использовать центробежную силу.   Возникающая в центрифуге центробежная сила, которая, строго говоря, создается ускорением, обычно выражается числом, кратным ускорению свободного падения g (g = 9,81 м/с2). Величины до 10000g получают с помощью простой настольной центрифуги, высокоскоростные рефрижераторные центрифуги позволяют достигнуть 50000g, а ультрацентрифуги, работающие с охлаждением и в вакууме, — 500000g.

Это просто маленько по-другому написано. Это то, что снизу

Макромолекулы или органеллы, незначительно различающиеся по размеру или по плотности, можно  разделить центрифугированием в  градиенте плотности. Для этих целей  используются два метода.

При зональном центрифугировании анализируемая проба (например, белки или клетки) наслаивается тонким слоем поверх буферного раствора. В процессе центрифугирования частицы проходят через раствор, так как их плотность выше плотности раствора. Скорость движения зависит от массы и формы частиц (см. формулы на схеме А). Центрифугирование прекращают прежде, чем частицы достигнут дна центрифужной пробирки. Затем дно прокалывают и собирают ряд фракций, содержащих различные частицы. Стабильность градиента плотности в процессе центрифугирования достигается применением растворов углеводов или коллоидного силикагеля, концентрация которых возрастает от поверхности к дну пробирки. Градиент плотности препятствует образованию конвекционных потоков, снижающих качество разделения.

При изопикническом центрифугировании пробу (например ДНК, РНК или вирусы) равномерно распределяют во всем объеме раствора (обычно CsCI). В этом случае разделение продолжается значительно дольше, чем при зональном центрифугировании. Градиент плотности создается в процессе центрифугирования за счет седиментации и диффузии. Со временем каждая частица попадает в область, соответствующую ее собственной плавучей плотности. Центрифугирование прекращают, когда устанавливается равновесие. Полученные фракции анализируют, используя подходящую измерительную технику.