Организация генома эукариот

Организация генома эукариот

Эукариоты. Геном эукариот. Количественные особенности генома эукариот

Главная количественная особенность генетического  материала эукариот –  наличие избыточной ДНК. Этот факт легко выявляется при анализе отношения числа генов к количеству ДНК в геноме бактерий и млекопитающих. Если средний размер гена бактерий 1500 пар нуклеотидов (п.н.), а длина кольцевой молекулы ДНК хромосомы Е. coli и В. subtilis составляет свыше 1 мм, то в такой хромосоме могут разместиться около 3 тысяч генов. Примерно такое число генов было экспериментально определено у бактерий по числу типов иРНК. Если это число умножить на средний размер гена, то получится, что около 95% генома бактерий состоит из кодирующих (генных) последовательностей. Остальные 5%, по-видимому, заняты регуляторными элементами. Иная картина наблюдается у эукариотических организмов. Например, у человека насчитывают приблизительно 50 тысяч генов (имеется в виду только суммарная длина кодирующих участков ДНК – экзонов). В то же время размер генома человека 3×10⁹ (три миллиарда) п.н. Это означает, что кодирующая часть его генома составляет всего 15…20 % от тотальной ДНК. Существует значительное число видов, геном которых в десятки раз больше генома человека, например некоторые рыбы, хвостатые амфибии, лилейные. Избыточная ДНК характерна для всех эукариот. В этой связи необходимо подчеркнуть неоднозначность терминов генотип и геном. Под генотипом следует понимать совокупность генов, имеющих фенотипическое проявление, тогда как понятие генома обозначает количество ДНК, находящееся в гаплоидном наборе хромосом данного вида.Нуклеотидные последовательности в геноме эукариот

В конце 60-х годов работами американских ученых Р. Бриттена, Э. Дэвидсона и других была открыта фундаментальная особенность молекулярной структуры генома эукариот – нуклеотидные  последовательности  разной степени повторяемости. Это открытие было сделано с помощью молекулярно-биологического метода изучения кинетики ренатурации денатурированной ДНК. Различают следующие фракции в геноме эукариот.

1.        Уникальные, т.е. последовательности, представленные в одном экземпляре или немногими копиями. Как правило, это цистроны – структурные гены, кодирующие белки.

2.        Низкочастотные повторы – последовательности, повторяющиеся десятки раз.

3.        Промежуточные, или среднечастотные, повторы – последовательности, повторяющиеся  сотни и тысячи раз. К ним относятся гены рРНК (у человека 200 на гаплоидный набор, у мыши – 100, у кошки – 1000, у рыб и цветковых растений – тысячи), тРНК, гены рибосомных белков и белков-гистонов.

4.        Высокочастотные повторы, число которых достигает 10 миллионов (на геном). Это короткие (~ 10 пн) некодирующие последовательности, которые входят в состав прицентромерного гетерохроматина.

ДНК мышей на 70% состоит из уникальных последовательностей, на 20% – из низкочастотных и среднечастотных повторов, на 10% – из высокочастотных.Повторы образуют так называемые семейства, под которыми понимают совокупность последовательностей, полностью или по большей части гомологичных друг другу.Нередко из-за существенных различий в нуклеотидном составе высокочастотных повторов и остальной ДНК первые образуют при центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия так называемые сателлитные пики, которые имеют большую или меньшую плавучую плотность, чем остальная ДНК. Эта фракция генома представлена небольшим (10…15) числом семейств коротких (5…12 п.н.) повторов, образующих протяженные блоки. Внутри блоков группы повторов отдельных семейств могут чередоваться друг с другом, так что сателлитная ДНК имеет как бы лоскутную структуру. Гибридизация фракций высокочастотных последовательностей с ДНК непосредственно на препаратах хромосом позволила установить, что эта фракция генома локализована в районах конститутивного гетерохроматина, чаще всего прицентромерного или теломерного. Еще в 30-х годах было показано, что в генетическом отношении эти районы инертны, т. е. не содержат генов. В действительности столь малые последовательности, составляющие сателлитную ДНК, не могут кодировать ничего, кроме олигопептидов. Более того, гетерохроматические районы не транскрибируются. Таким образом, в случае высокочастотных последовательностей ДНК обнаруживается тождество молекулярной организации и генетических свойств хромосомной ДНК эукариот. Следует отметить, что эта фракция у огромного большинства видов занимает не более 10% генома. Близкие виды, например мышь и крыса, имеют совершенно различные высокочастотные последовательности, у крысы их нуклеотидный состав не отличается от основной ДНК, тогда как геном мыши содержит четкий АТ-богатый сателлит. Это означает, что высокочастотная ДНК способна к быстрым изменениям в ходе видообразования.

Остальные 90 % генома эукариот, его эухроматическая часть, построены по принципу чередования (интерсперсии) уникальных и повторяющихся последовательностей. Условно выделяют два основных типа интерсперсии, получивших названия по тем видам, у которых они впервые были описаны: интерсперсия типа «ксенопус» (обнаружена у шпорцевой лягушки Xenopus laevis) и типа «дрозофила» (впервые описана у плодовой мушки D. melanogaster). Примерно в 50 % генома Xenopus laevis уникальные последовательности из 800…1200 п.н. чередуются с повторяющимися, средний размер которых 300 п.н. В остальной части геномов типа «ксенопус» расстояния между соседними повторами значительно превышают 1…2 п.н. Структура генома типа «ксенопус» широко распространена, особенно среди животных. Млекопитающие и человек также относятся к этому типу организации генома. Особенность генома человека и других приматов составляют интерсперсные высокочастотные повторы длиной около 300 п.н. У человека эти повторы содержат сайт, разрезаемый ферментом рестрикции Alu I. Число Alu-подобных повторов в геноме человека достигает 5×10⁵, а по некоторым данным, даже 10⁶.

Alu-подобные последовательности приматов представляют собой частичные дупликации (удвоения) последовательности В1 в геноме грызунов, впервые описанной Г. П. Георгиевым и его сотрудниками.

У D. melanogaster параметры интерсперсии резко отличаются от видов с типом генома «ксенопус»: повторяющиеся последовательности длиной 5600 п.н. чередуются с уникальными, длина которых не менее 13000 п.н. Интересно отметить, что у домашней мухи геном устроен по типу «ксенопус». Этот факт прямо указывает на то, что в ходе эволюции возможны очень быстрые преобразования характера чередования последовательностей и в эухроматической части генома. Птицы по параметрам интерсперсии занимают промежуточное положение между типом «ксенопус» и типом «дрозофила». Как показывают результаты исследований последних лет, многие виды животных и растений по организации генома не могут быть строго отнесены ни к тому, ни к другому типу. Так, в геномах млекопитающих встречаются длинные повторы – в несколько тысяч пар нуклеотидов, в геномах лилейных до 90% ДНК может быть представлено повторяющимися последовательностями. Например, геном гороха не содержит уникальных  последовательностей, превышающих по длине 300 п.н.

Другая  особенность повторяющихся последовательностей в геномах эукариот – инвертированные повторы, или палиндромы (см. ниже). В условиях ренатурации они практически мгновенно формируют дуплексные структуры. По существу, палиндромы представляют собой часть промежуточных повторов. Однако некоторые высокочастотные повторы в эухроматической части генома, например члены Alu-семейств, могут встречаться как в прямом, так и в инвертированном положении. Иногда между инвертированными повторами вклиниваются другие последовательности. 

Гетерогенность  ДНК эукариот по нуклеотидному составу

У эукариот описаны некоторые особенности структуры ДНК, обусловленные спецификой нуклеотидного состава отдельных последовательностей. Так, встречаются расположенные в одной цепи блоки нуклеотидов, состоящих из нескольких десятков пуринов. Тогда комплементарная часть в другой цепи ДНК будет представлена пиримидинами. Подобные последовательности названы полипуриновыми (полипиримидиновыми) блоками.

Другой  вид гетерогенности связан с неравномерностью содержания по длине ДНК пар аденин–тимин (АТ–пары) и гуанин–цитозин (ГЦ–пары). Так, в геноме дрозофилы периодически встречаются последовательности длиной примерно в 100 п. н., на 85 % состоящие из АТ–пар. Поскольку аденин связан с тимином двумя водородными связями, а гуанин с цитозином — тремя, дестабилизирующие ДНК-воздействия будут легче инициировать расплетание дуплексов ДНК с образованием участков частичной денатурации в АТ-богатых областях. Поэтому последние рассматриваются в качестве сайтов инициации элементарных генетических процессов: репликации, транскрипции и рекомбинации.

В заключение отметим, что перечисленные  выше особенности молекулярной структуры ДНК эукариот не были предсказаны ни классической генетикой (за исключением, пожалуй, свойств гетерохроматина), ни моделью двойной спирали Уотсона и Крика. Они были раскрыты при исследовании структуры геномов различных эукариотических организмов физико-химическими методами. Функции большинства повторяющихся и уникальных последовательностей пока не определены. Однако вполне вероятно, что сама по себе молекулярная структура ДНК эукариот служит зеркалом генетической регуляции и эволюции высших животных и растений. 

Хроматин  и компактизация хромосом

Основой генетического аппарата эукариот являются линейные хромосомы. В основе хромосомы  лежит линейная двуспиральная правозакрученная молекула ДНК, связанная со специфическими белками-гистонами. Известно 5 типов  гистонов: Н1, Н2А, Н2В, НЗ, Н4. В ядрах эритроцитов птиц Н1 частично замещается на Н5. У дрожжей отсутствует Н1, а у некоторых видов хламидомонад гистоны вообще не обнаружены. Гистоны отсутствуют также у мезокариот (одноклеточных организмов – динофлагеллят, ночесветок), в сперматозоидах некоторых рыб. Отсутствие гистонов в перечисленных случаях рассматривается как вторичное явление. Гистоны Н2 – Н4 эволюционно устойчивы: из 102 аминокислот Н4 наблюдаются различия лишь по 1-2 аминокислотам у высших растений, рыб и млекопитающих. Гистон Н1 весьма вариабелен, и даже в тканях одного организма встречается 3 – 6 вариантов этого белка.

Гистоны Н2 – Н4 образуют белковое ядро из 8 полипептидов (каждый гистон повторяется 2 раза). Вокруг этого ядра уложен участок ДНК длиной 140 пн, образующий 1,75 витка по периферии. Такая структура называется нуклеосома. Отдельные нуклеосомы – это дисковидные частицы диаметром около 10 нм. Закручивание ДНК вокруг нуклеосомы уменьшает ее длину в семь раз. Участки ДНК между нуклеосомами длиной 15…10 пн называются линкерами (связками). Структура линкеров стабилизируется с помощью гистона Н1.

Последовательность  нуклеосом образует или еще одну спираль диаметром 25…20 нм (соленоид), или последовательность нуклеосомных группировок – нуклеомеров. Эти высшие структуры образуют петли или домены. Конденсация ДНК в структуре соленоида дополнительно (к нуклеосомному уровню) уменьшает ее длину в шесть раз. В интерфазных хромосомах путем еще одного цикла конденсации соленоиды образуют полые трубочки диаметром 200 нм, что уменьшает длину ДНК еще в 18 раз.

Описанная структура хромосом у эукариот обеспечивает их устойчивость и недоступность основной массы ДНК для химических мутагенов. При транскрипции, т.е. синтезе РНК, и репликации происходит деспирализация хромосом, что обеспечивает возможность контакта определенных участков ДНК с ДНК-полимеразой или РНК-полимеразой.

Определенные  участки хромосом в ядре тесно  связаны с ядерной мембраной. Всегда связаны с мембраной концевые (теломерные) участки и некоторые другие (интерстициальные) участки. Такие связи обеспечивают определенную структуру ядра и защищают хромосомы от разрушения ферментами-нуклеазами. Ю. С. Ченцовым и его сотрудниками открыта специальная частица, обеспечивающая связь хроматина с ядерной мембраной, которую предложено называть анкоросомой (якорной частицей).

В метафазе вследствие дальнейшей конденсации  возникает большая образованная дезоксинуклеопротеидом спираль диаметром около 600 нм. В результате строго упорядоченной иерархии спиралей, в основе которой лежит нуклеосома, в митозе и мейозе хромосомы эукариот совершают цикл компактизации — декомпактизации. Следствие этого цикла — укорочение метафазных хромосом по сравнению с размерами заключенной в них молекулы ДНК в 10³…10⁴ раз. По-видимому, цикл компактизации—декомпактизации регулируется белками хроматина негистонового типа. Возможно, что некоторые из них выполняют и структурную роль, образуя элементы каркаса метафазных хромосом. Особенности репликации эукариотических хромосомю.ак и у прокариот, репликация ДНК в клетках эукариотических организмов осуществляется полуконсервативно, о чем свидетельствует распределение Н-тимидиновой метки по сестринским хроматидам во втором и последующих митозах после инкубации клеток с радиоактивными предшественниками. Выяснено, что репликация у эукариот носит двунаправленный характер.

Принцип регуляции репликации ДНК эукариот в онтогенезе был открыт английским цитогенетиком Г. Кэлланом в 1972 г. С помощью радиоавтографии меченных ³Н-тимидином волокон ДНК, полученных из клеток животных непосредственно на предметном стекле, Кэллан определил скорость репликации и расстояние между соседними центрами инициации в S-фазе соматических и эмбриональных клеток.

По  первому показателю между этими  типами клеток больших различий не наблюдалось. Число сайтов инициации репликации было максимальным в раннем эмбриогенезе, минимальным в предмейотической S-фазе и промежуточным в соматических клетках. Эти данные в принципе были подтверждены позднее прямым электронно-микроскопическим анализом реплицирующейся ДНК из дробящихся яиц дрозофилы. Таким образом, суть регуляции процесса репликации у эукариот заключается в изменении числа сайтов инициации репликации. Этот механизм позволяет увеличить продолжительность фазы S (а, следовательно, всего митотического цикла) с 3,5 мин (на ранних стадиях дробления яиц дрозофилы) до десятков часов в предмейотической S-фазе. Упаковка ДНК и гистонов в нуклеосомы происходит в фазе S, поскольку гистоны синтезируются синхронно с репликацией ДНК. Переключение генов у эукариот