Вид Campylobacter

Также три последних серии  экспериментов, проведенных на пластике, дали неожиданные результаты. Несмотря на тот факт, что ни один из микроаэрофильных штаммов не производит видимую биопленку, C.jejuni штамм 81- 176 произвели величину в исследованиях биопленки, которая была значительно больше (р<0.05) чем те, которые были произведены негативным контролем (Табл.1С). Тем не менее, 81- 176 штаммы были единственными в исследованиях биопленки, которые значительно отличались от четырех из других девяти видов Campylobacter; ни один из девяти видов не произвел видимую биопленку.

Количественные исследования биопленки анаэробных штаммов выращенных на стекле (Табл.2А) только частично соответствуют  количественным исследованиям биопленки  представленным в табл.2. Пока каждый из анаэробных штаммов производит видимую биопленку на стеклянной пластине в каждом эксперименте, в качественных исследованиях судят только усредненные величины результатов трех их трех штаммов (С. showae, C. concisus, C. rectus), чтобы иметь значительно разнящиеся величины (р<0.05) с негативным контролем. Кроме того, C.gracilis видимо отличается от негативного контроля с погрешностями, произведенными стандартными погрешностями, полученными из данных. Однако, метод Бонеферонни ЛСД использовавшийся в этих анализах не считает это очевидное различие значительным.

Аналогично, количественные результаты производства биопленки  анаэробными штаммами на нержавеющей  стали не соответствовали предыдущим качественным результатам (Табл. 2В). Наблюдения показали, что все анаэробные штаммы производят видимую биопленку на некоторые купоны из нержавеющей  стали, использованных в нескольких экспериментах. Тем не менее, качественные исследования судят только по усредненным  результаты (производства ) биопленки  одного из штаммов (C.showae), чтобы значительно отличаться ( р<0.05) от негативного контроля. Два дополнительных штамма (С.concisus, C.curvus) видимо отличались от негативного контроля с учетом стандартной погрешности, но это не подтвердилось Bonferroni LSD анализом.

В конце концов, испытания  биопленки для анаэробных штаммов  на пластике (Табл.2) продолжают (создавать, выпускать) результаты не соответствующие  данным качественно представленными  в Табл.2. Аналогично результатам  испытаний с нержавеющей сталью, все анаэробные штаммы производили  видимую биопленку на некоторые  пластиковые купоны (пластины), использовавшиеся в нескольких экспериментах. На этот раз в количественных испытаниях судились усредненные результаты биопленки  двух штаммов (C.showae, C.cutvus), чтобы быть значительно отличными (р <0.05) от негативного контроля. В этой серии экспериментов анализ Bonferroni LSD полностью согласился со стандартной погрешностью.

Измерение пластин после 30 или 48 часов роста было сделано для каждого представленного штамма видов Campylobacter в среде и условиях роста использовавшихся в испытаниях  биопленки без наличия пластин (купонов). Измерение пластин после 48 часов роста и соответствующая концентрация бактерий значительно отличалась среди многих видов микроаэрофильных Campylobacter (Табл.3). Измерения пластин и концентрации бактерий у анаэробных штаммов, росших 30 часов, были значительно более однородные и выявляли аналогичные темпы роста. Относительно низкие измерения пластин некоторых микроаэрофильных видов, росших 48 часов, пробудили нас повторить испытания  биопленки на стеклянных купонах, дающих больше времени для развития биопленки. После 120 часов роста обнаружили слабые биопленки сформировавшиеся на стеклянных пластинах видами C.helveticus и C.upsaliensis. ни один из других микроаэрофильных штаммов, за исключением 81-176, не произвели биопленки после дополнительного инкубационного периода.

3.3 Прямое наблюдение  за формированием биопленки методом  сканирующей электронной микроскопией.

Сканирующая электронная  микроскопия была использована для  визуализации биопленки видов Campylobacter образованных на стекле. Были получены изображения образцов, показывающие общий вид биопленки (250x) и морфологию отдельных видов Campylobacter формирующих биопленку (2500x или 10,000x) (Табл.4А- С). Для пяти из шести анаэробных видов, морфология бактериальных штаммов, содержащих биопленку была относительно однородной, с бактериями в форме спиралей и изогнутых стержней. Не большоей количество коккоидных форм или полное их отсутствие наблюдалось в биопленке сформированной C.curvus (табл.4А), С.rectus (табл.4В), C.consisus (табл.4С), C.showae (табл. D) и C.gracilis (табл. 4Е). В то время как анаэробные виды C.mucosalis (табл.4F) формируют биопленку, содержащую большое количество коккоидных форм и несколько спиральных форм. Сформированная биопленка также относительно редко состояла из нескольких клеток и покрывала пластину пятнами, что говорит о нездоровой (опасной ) биопленки. Один микроаэрофильный штамм, который формирует биопленку на стекле, C.jejuni 81-176, формирует более морфологически гетерогенную биопленку. В биопленке были обнаружены и спиральная, и кокковидная формы бактерии примерно в одинаковых пропорциях. Для подтверждения того, что бактерия, формирующая биопленку была действительно видом Campylobacter, который использовался для инокуляции растущей культуры, каждый из видов бактерий был выращен на отдельной агарной? пластине (или пластине агар). Колония была собрана с пластины, лизированна и хромосомный ДНК был собран для секвенсирония гена 16S rRNA. Затем, другая колония с той пластины была собрана и обследована сканирующим электронным микроскопом, для визуализации морфологии клеток конкретных бактерий. Таким образом, идентичность и морфология клеток каждого из Campylobacter видов были четко установлены. Это позволяет нам визуализировать, используя SEM, морфологию клеток видов Campylobacter, чья идентичность была подтверждена секвенсированием гена 16S rRNA. Это дало нам уверенность в том, что Campylobacter формирующий биопленки был тот же вид Campylobacter, который изначально использовался для инокуляции культуры. Результатом этого сравнения было то, что вся биопленка формирующая штаммы Campylobacter была успешно подтверждена в отношении идентичности их видов.

4. Исследование

Начальные исследования изучали  возможности формирования биопленки  видами Campylobacter и были сосредоточены исключительно на C.jejuni и не обращали внимания на другие разновидности рода (Дайкес и др., 2003; Трачу и др., 2002; Бак и др., 1983; Летхола и др., 2006; Калмокоф и др., 2006; Джошуа и др., 2006). Наши результаты указывают на то, что вероятность формирования биопленки преобладает у анаэробных видов Campylobacter  по сравнению с микроаэрофильными видами. Большинство анаэробных штаммов Campylobacter были изначально изолированы мест (очагов ) периодотальных заболеваний (Мачуч и Таннер, 2000). Считается, что формирование биопленки играет свою роль в периодонтальных заболеваниях; поэтому не удивительно, что анаэробные штаммы показывают хорошие результаты в формировании биопленки на целом ряде поверхностей (Филстром и др.,  2005). Только микроаэрофильный штамм, который показал большую вероятность формирования биопленки, был C.jejuni штамм 81-176. Странно, но C.jejuni штамм RM 1221 показал небольшую, если таковая вообще имеется, способность формирования биопленки в тех же условиях. Значительная разница в способности формирования биопленки между двумя штаммами одних и тех же видов указывает на то, что потенциал формирования биопленки не может быть предсказан одной лишь идентичностью видов. Это говорит о том, что множество штаммов внутри вида должны быть полностью исследованы для полного определения потенциала формирования биопленки разными видами.

В этом исследовании были изучена  стеклянная, полистирольная, а также  поверхность из нержавеющей стали. Принято считать, что бактерии легче  присоединяются к гидрофобной поверхности. Из трех исследованных поверхностей нержавеющая сталь самая гидрофобная  поверхность, затем пластик и  стекло (Тиксейраа и др., 2005). Некоторые  из Campylobacter видов были способны формировать биопленку на всех поверхностях, другие только на определенное подмножество (подгруппу) поверхностей, и некоторые были неспособны сформировать биопленки на любые исследованные поверхности. Наблюдения показали, что из трех материалов большое разнообразие видов Campylobacter были способны прикрепиться к поверхности нержавеющей стали. Также у нержавеющей стали было преимущество в том, что ее поверхность была наиболее грубой из всех исследованных материалов. Тем не менее, стеклянная поверхность, которая является наиболее гидрофильной из трех материалов, обеспечивает бесконечное повторение присоединения Campylobacter. И наконец, пластиковые купоны (пластины), которые должны иметь гидрофобную величину (значение ) между нержавеющей сталью и стеклянными купонами, являются скудной поверхностью для присоединения Campylobacter. Эти измерения способности видов Campylobacter формировать биопленки на различных поверхностях, говорят о том, что необходимы исследования дополнительных типов материалов. С тех пор как Campylobacter ответственны за большую процентную долю пищевых инфекций очень важно иметь всю информацию о возможности видов Campylobacter формировать биопленку на продуктах, поверхностях имеющих непосредственное отношение к приготовлению пищи, а также ее хранению.

Сравнение наших качественных и количественных измерений формирования биопленки показало некоторые расхождения  между результатами, полученными  каждыми способами. Видимую биопленку  не всегда можно было соотнести со значительной разницей значения абсорбции, по сравнению с отрицательным  контролем или культурами где  биопленка плохо заметна невооруженным  глазом (табл. 1В, табл. 2А-С). Это говорит  о том, что возможно в текущих  количественных исследованиях биопленки  возникли какие- либо проблемы. Основным вопросом наблюдения является: происходит ли смещение частиц прикрепившейся биопленки  во время окрашивания кристаллической  фиолетовой краской и промывки образцов. Смещение (потеря) биопленки с купонов  приведет к различиям между образцами  копий, что отразится очень большими и вводящими в заблуждение  погрешностями. Шаг фиксации тепла  исследования был первоначально  введен для решения вопроса о  потери биопленки с поверхности  купона во время обработки (Поутри и  др., 2002). Шаг фиксации тепла был  очень полезен, но судя по нашим результатам  нужны дальнейшие совершенствования.

Исследования, проведенные  сканирующей электронной микроскопией различных видов Campylobacter способных произвести биопленку, показали интересные факты (наблюдения). Значительно меньшее количество коккоидных форм у бактерий наблюдалось в биопленках формированных анаэробными видами, по сравнению биопленками формированными микроаэрофильными штаммами, C.jejuni 81-176, который был способен последовательно производить биопленки. Было высказано предложение, что появление коккоидных форм Campylobacter может быть ответной реакцией на плохое воздействие окружающей среды, включая кислородные стрессы (Моран и Аптон, 1987). Это может быть полезной информацией для определения наличия большой доли (можно также процентной доли) коккоидных форм в биопленке сформированной в микроаробной среде, в сравнении с теми, которые формируются в аэробных условиях, это вызвано разным содержанием кислорода в двух этих средах. особого внимания заслуживает особая манера, в которой большое количество C.rectus растут, когда формируют биопленку. Бактерии часто растут в маленьких, хорошо организованных очагах, с излучающими клеткам бактерий, имеющих один конец каждой клетки, направленный в сторону центральной точки. Механизмы и причины  этой интригующей морфологии не известны.

Род Campylobacter состоит из нескольких патогенных видов, которые виноваты в целом ряде заболеваний у людей и домашних животных: понос, сепсис, спонтанные аборты (дословно), менингит, неврологические расстройства и заболевания пародонта (Он, 1996). Эти организмы, как правило, привередливые и очень чувствительны к уровню кислорода (21% О2)  в атмосфере (Он, 1996). Не взирая ни на что, эти бактерии каким-то образом способны выживать в неблагоприятной окружающей среде. Принято считать, что формирование биопленки и возможный способ выживания. Вот почему так необходимо изучить все возможности формирования биопленки всеми представителями данного рода (вида). Мы надеемся, что эти начальные этапы исследований дадут вам достаточно материала для формирования базы, для дальнейших исследований.

5.Благодарности

Мы хотим поблагодарить  Джонни Алмонда и Лай Нгуен  за техническую поддержку, доктора  Питера Кука за предоставленные данные о электронной сканирующей микроскопии  в этом исследовании и доктора  Джона Филипса за статистические анализы в исследованиях биопленки. А также мы хотим поблагодарить  докторов Пина Фратамико и Джона  Лучански за просмотр (рецензирование) этой научной работы.