Полимеразная цепная реакция

 

_{3.1.1 Способ постановки ПЦР с использованием “горячего старта"}

Чтобы уменьшить риск образования  неспецифических продуктов реакции  амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт" (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Дело в том, что в  зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции.

Существуют различные  варианты реализации "горячего старта":

Внесение в реакционную  смесь Taq-полимеразы во время первого цикла после прогрева пробирки до температуры денатурации.

Разделение ингредиентов реакционной смеси парафиновой  прослойкой на слои (в нижней части - праймеры, в верхней - Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые смешиваются при расплавлении парафина (~65-75⁰С).

Использование моноклональных антител к Taq-полимеразе. Фермент, связанный моноклональными антителами, становится активным лишь после стадии первой денатурации, когда моноклональные антитела необратимо денатурируют и освобождают активные центры Taq-полимеразы.

Во всех перечисленных  случаях, даже если неспецифический  отжиг произошел до начала температурного циклирования, элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.

 

_{3.1.2 Детекция молекул РНК}

Возможность использования  РНК в качестве мишени для ПЦР  существенно расширяет спектр применения этого метода. Например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирус инфлюэнцы, пикорнавирусы и т.д.) представлены именно РНК. При этом в их жизненных циклах отсутствует промежуточная фаза превращения в ДНК. Для детекции РНК необходимо в первую очередь перевести ее в форму ДНК. Для этого используют обратную транскриптазу, которую выделяют из двух различных вирусов: avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus. Использование этих ферментов связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, они термолабильны и поэтому могут быть использованы при температуре не выше 42° С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Предпринимаются попытки обойти этот недостаток используя в качестве обратной транскриптазы термостабильную полимеразу, полученную из термофильного микроорганизма Thermus Thermophilus, проявляющего транскриптазную активность в присутствии Mn²⁺. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную так и транскриптазную активность.

Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси  также как и в ПЦР должны присутствовать праймеры в качестве затравки и смесь 4-х дНТФ, как строительный материал.

После проведения реакции  обратной транскрипции полученные молекулы кДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР

 

_{Заключение}

 

В настоящее время метод  ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются  всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок  поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных  для выявления нуклеотидных последовательностей  различных микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с  каждым разом снижают себестоимость  ПЦР-анализа, делая его доступным  для широкого использования в  диагностических и лечебных целях.

Диагностика инфекционных заболеваний  является наиболее частым приложением  ПЦР в многопрофильных медицинских  учреждениях. Что касается более  широких возможностей ПЦР-исследований в медицине и смежных областях, то среди них можно упомянуть  следующие приложения.

1. Диагностика инфекций. Наиболее востребована ПЦР-диагностика  вирусов (главным образом, вирусов  гепатитов В и С, а также группы герпеса), а также возбудителей скрытых инфекций, передающихся половым путем (хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз и др.).

2. Судебно-медицинская экспертиза  и смежные области. Идентификация  личности подозреваемых и потерпевших  лиц по анализам ДНК. С этими  вопросами методически связаны  задачи установления отцовства  (материнства) или иного кровного  родства.

3. Онкология, онкогематология, трансплантология. Выявление специфических онкогенов и антионкогенов (особенно в диагностике лейкозов и лимфом), которое обычно проводится с образцами РНК из клеток больных. Из проб РНК с помощью обратной транскриптазы получают комплементарную ДНК, в которой и выявляют искомые онкогены, характерные для отдельных типов лейкозов и лимфом. Кроме того, при трансплантации костного мозга и внутренних органов необходима диагностика НLА-антигенов, которая сейчас проводится с применением мультиплексной ПЦР, выявляющей широкий спектр генов совместимости.

4. Медицинская генетика. Диагностика мутаций, характерных  для редких генетических заболеваний  (в т. ч. пренатальная диагностика и установление носительства данного гена у родителей); обнаружение частых генных вариантов, связанных с предрасположенностью к определенным заболеваниям. За последние 10 лет приобрели популярность методы выявления у больных различных генных вариантов (аллелей генов), определяющих повышенный риск тромбоза и побочных эффектов некоторых лекарственных препаратов. Также в последние 5 лет разработаны и активно применяются исследования генетически модифицированных продуктов питания на предмет соответствия существующим санитарно-гигиеническим нормативам.

Необходимо помнить, что, во-первых, метод ПЦР должен применяться  клиницистами осмысленно, и врач, решивший использовать ПЦР в своей, работе должен обладать определенными знаниями об особенностях и возможностях данного  метода. Во-вторых, между клиницистом  и ПЦР-лабораторией должна существовать тесная обратная связь, необходимая  для анализа сложных случаев  и выработки правильной диагностической  стратегии. В-третьих, ПЦР-анализ не является панацеей в диагностике и не заменяет существующие методы исследований, а  лишь дополняет их. И главное - ПЦР  не может заменить интуицию и аналитическое  мышление, которыми должен обладать врач, рассчитывающий на успех

Список использованной литературы

 

1. Щербо С.Н. ПЦР в клинической лабораторной диагностике: реальности и перспективы //Справочник заведующего КДЛ 2006. №10 с. 45-60

2. Чухловин.А.Б. Метод ПЦР в клинической лабораторной диагностике // Справочник заведующего КДЛ. 2008. №4 с.36-50

3. Веб-ресурс для специалистов клинико-диагностических центров http://www.primer.ru/