Молекулярно-генетические методы исследования и их применение в медицине

Молекулярно-генетические методы исследования и их применение в  медицине.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (М-Г) 

Молекулярно-генетические методы - большая и 

разнообразная группа методов, предназначенная

 для  выявления вариаций (повреждений)  в 

структуре участка ДНК:

• аллеля,
• гена,
• региона хромосомы

вплоть  до расшифровки первичной 

последовательности  оснований

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (М-Г) 

• В основе м-г методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК

 

 

• Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК

 

• Источником  геномной ДНК могут  быть любые ядросодержащие клетки.

Материал  для ДНК-диагностики 

На  практике чаще используют:

• лейкоциты
• хорион
• амниотические клетки
• культуры фибробластов
• волосы, ногти, слюна

 

• Возможность проведения молекулярно-генетического  анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы.

Материал  для ДНК-диагностики 

• Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости  от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК.

Для этого  требуется действительно небольшое 

количество  биологического материала:

• 20-40 мг хориона,
• 1 мл крови,
• 5-10 мг культуры клеток

Материал  для ДНК-диагностики 

Для осуществления  определенных методов достаточно:

• 1 капли крови
• соскоба эпителия со щеки
• несколько волосяных луковиц и т.д.

Методическое  преимущество м-г анализа 

• Небольшое  количество легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом  методов молекулярно- генетического анализа

 

• Выделенная  ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов методов и может долго сохраняться в замороженном виде.

Исходные  условия для проведения м-г методов 

• Оснащение молекулярно-генетической лаборатории
• Специальная подготовка материала исследования в соответствующих лабораториях
• Получение образцов ДНК (или РНК) - исходный этап всех методов.

 

   Этот  этап реализуется в двух вариантах: 

• а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток;
• б) накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью полимеразной цепной реакции.

Рестрикция 

• Рестрикция  ДНК на фрагменты является необходимым  этапом в молекулярно-генетической диагностике.
• Этот процесс осуществляется #рестриктазами#, относящимся к группе бактериальных эндонуклеаз.
• В генетике человека используется несколько десятков разных рестриктаз.

Рестриктазы 

• Основное  свойство рестриктаз - разрывать двухцепочечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фрагмента последовательностях нуклеотидов протяженностью 4-6 пар оснований (редко больше).

 

• При обработке  геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.

Электрофорез  фрагментов ДНК 

• Электрофорез  фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля.

Электрофорез  фрагментов ДНК 

• Фрагменты ДНК движутся в геле,
• помещенном в постоянное электрическое поле,
• от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле).

Электрофорез  фрагментов ДНК 

• После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля.
• Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

Наследственные  болезни: методы прямой диагностики  мутаций 
 

   Прямая диагностика мутаций включает несколько методов:

• определение нуклеотидной последовательности (секвенирование);
• выявление нарушения места рестрикции;
• аллельспецифическую гибридизацию с синтетическими олигонуклеотидными зондами;
• химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильного сшивания оснований;
• регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК;
• трансляцию белкового продукта in vitro.

Метод нуклеотидной последовательности 

• Непосредственная диагностика патологических мутаций путем определения нуклеотидной последовательности является наиболее точным методом.

 

  Позволяет  достоверно выявлять:

• замены оснований,
• делеции
• вставки на всем протяжении изучаемого фрагмента.

Метод нуклеотидной последовательности 

Недостатки  метода:

• трудоемкость секвенирования
• высокая стоимость ,

что частично ограничивает применение этого

  варианта прямой  детекции мутаций.  

Перспективы: развитие автоматизации

 секвенирования позволяет надеяться, что в будущем

этот метод  займет ведущее место в диагностике

 наследственной  патологии.  

Метод выявления  мутаций по нарушению рестрикции 
 

• Выявление нарушения места рестрикции осуществляется с помощью блот-гибридизации по Саузерну .
• При обработке соответствующей рестриктазой в геле отсутствуют фрагмент ДНК, выявляемый у нормальных индивидов.
• Примерно 50% нуклеотидных замен приводит к изменению места (или сайта) рестрикции, благодаря чему возможна прямая детекция мутаций на основе рестриктного анализа.

Метод выявления  мутаций гибридизацией с зондом 
 

• Аллельспецифическая гибридизация с олигонуклеотидными зондами позволяет обнаруживать мутации в геномной ДНК

 

• Последовательность оснований в олигонуклеотидном зонде может быть задана по нормальному или патологическому варианту гена, затем помечена

 

•  И  в том, и в другом случае  такой зонд используется для гибридизации с фрагментом ДНК обследуемого индивида.

Метод выявления  мутаций по расщеплению ДНК 
 

• Химическое (или ферментативное) расщепление  ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК.

 

• Мутации в молекуле ДНК  могут изменять электрофоретическую  подвижность фрагмента  ДНК.

Метод выявления  мутаций по расщеплению ДНК 
 

• Во-первых, могут изменяться температурные показатели плавления двухцепочечных фрагментов, что можно определить с помощью электрофореза двухцепочечной ДНК в градиентном денатурирующем геле (так называемый денатурирующий гель-электрофорез).

Метод выявления  мутаций по расщеплению ДНК 
 

• Во-вторых, в результате мутации изменяться конформация одноцепочных фрагментов, что выявляется путем электрофореза предварительно денатурирующих ДНК в неденатурирующих условиях

 

• В-третьих, проводиться так называемый гетеродуплексный анализ, с помощью которого обнаруживаются нарушения линейности гетеродуплексов в местах коротких вставок и делеций

 

Суть  этого варианта электрофорез ДНК в нейтральном  или равномерно денатурирующем геле 

Метод выявления  мутаций по трансляции белков 
 

• Трансляция  белкового продукта осуществляется в системе in vitro на основе полученной специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов (в нем содержатся все необходимые компоненты для синтеза белка).
• В этой системе синтезируется белковый продукт соответствующего гена.