МИНИСТЕРСТВО  ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «ГОМЕЛЬСКИЙ  ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» 
 
 

Кафедра патологической физиологии 
 
 
 
 

Методы  диагностики наследственных болезней 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Подготовила студентка группы Д-304

Кадовба Дарья Васильевна 
 

Гомель, 2010

   В настоящее время практическая медицина имеет целый арсенал диагностических  методов, позволяющих с определённой вероятностью выявлять наследственные заболевания. Диагностическая чувствительность и специфичность этих методов  различна - одни позволяют только предположить Наличие заболевания, другие с большой точностью выявляют мутации, лежащие в основе болезни или определяющие особенности её течения.

Биохимические методы диагностики наследственных болезней. Иммуно-гистохимический метод.

   Характерные изменения биохимических показателей, выявляемые при той или иной наследственной патологии, служат постоянным, а иногда и единственным признаком заболевания. Кроме того, отклонения в биохимических параметрах, как правило, предшествуют возникновению клинических симптомов, и существенно не зависят от клинико-генетического полиморфизма, обусловливающего вариабельность заболевания по степени тяжести и времени начала манифестации. Таким образом, биохимические параметры можно считать наиболее информативным описанием фенотипа. Подтверждением этого являются биохимические показатели гетерозигот, значения которых часто занимают промежуточное положение между значениями у нормальных и патологических гомозигот: например, гетерозиготные носители рецессивного аллеля фенилкетонурии симптомов заболевания не имеют, но реагируют на введение фенилаланина более сильным повышением концентрации этой аминокислоты в плазме, чем нормальные гомозиготы.

   К тому же не для всех наследственных заболеваний обнаружен молекулярно-генетичсский дефект или имеются возможности для его выявления. В связи с этим, биохимические методы играют важнейшую роль в диагностике наследственных заболеваний, позволяя подтверждать диагноз в случае атипичной клинической картины, проводить доклиническую диагностику и начинать лечение на ранних стадиях заболевания, выявлять гетерозиготных носителей, дифференцировать генетически различные формы болезни со сходной клинической картиной. Результаты диагностики гетерозиготного носительства биохимическими методами могут быть использованы в практике медико-генетического консультирования при расчетах риска рождения ребенка с наследственным заболеванием на основе вероятностных подходов.

   Предметом биохимической диагностики могут быть различные классы органических и неорганических веществ (аминокислоты, углеводы, липиды, мукополисахариды, ионы металлов и др.) и их метаболиты, концентрация и отклонения в активности ферментов. Универсальность биохимической диагностики состоит в том, что исследовать этими методами можно любую ткань или секрет организма (мочу, пот, кровь, слюну, мышцы и др.). Это обусловливает многообразие биохимических методов и необходимость их непрерывного совершенствования.

   Безусловно, биохимические методы играют первоочередную роль в диагностике наследственных нарушений обмена веществ (НБО). Универсальность этих методов позволяет использовать их в дифференциальной диагностике и для выявления гетерозиготного носительства другой моногенной патологии, при которой изменение биохимических показателей является вторичным: например, при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера (ПМДД/Б) повышается уровень креатин-фосфокиназы (фермент мышц) в крови больных при начальной и развернутой стадии заболевания, а также и у 30% носительниц гена ПМДД/Б.

   Для диагностики ряда состояний используют комбинированные биохимические методы. Так иммуно-генетическое тестирование позволяет поставить или уточнить диагноз при врожденных иммунодефицитных состояниях, при подозрении на антигенную несовместимость матери и плода по тем или иным системам групп крови. Иммуно-гистохимический метод используется для выявления той или иной белковой субстанции в какой-либо ткани при помощи специфичных антител (именно так проводят дифференциальную диагностику поясно - конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий и ПМДД/Б: исследуют мышечные волокна на наличие или отсутствие в них дистрофина при помощи антител, специфичных для С-домена, Rod-домена и N-конца белка дистрофина).

   С каждым годом совершенствуясь, биохимические  методы становятся все более сложными, многоступенчатыми, а, следовательно, и дорогими. Использовать их для программ массового скрининга наследственных болезней, многие из которых встречаются в популяциях с сравнительно низкой частотой, невыгодно. Необходимо предварительное «просеивание» популяции.

   Биохимические методы подразделяют на качественные, количественные и полуколичественные.

   Качественные  реакции позволяют обнаружить избыточные концентрации субстратов блокированной ферментной реакции или их производных, накапливающихся при НБО. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, отличаются низкой себестоимостью и не дают ложноотрицательных результатов, а информация, полученная с их помощью, позволяет с высокой долей вероятности заподозрить НБО у пациента. Однако на результаты этих тестов влияет применение ряда лекарственных препаратов и их метаболитов, а также некоторых пищевых добавок. Качественные пробы бывают: универсальными (выделяется группа заболеваний, класс веществ; например, ЦПХ-тест для мукополисахаридов) и специфическими (на цистин-гомоцистин, метилмалоновую кислоту и др,). Наиболее распространены качественные тесты с мочой, вследствие доступности и простоты получения материала для исследования.

   Полуколичественные  и количественные тесты проводятся как с мочой (тест с цианид-нитропруссидом - гомоцистинурия, цистинурия; ЦПХ-тест — мукополисахаридозы), так и с кровью (газы крови, глюкоза, ионы аммония, молочная кислота, кетоновые тела, пировиноградная кислота, холестерин, триглицериды) и могут иметь различную степень сложности. Наиболее простые из них, такие как измерение концентрации лактата, пирувата, кетоновых тел, ионов аммония, а также определение кислотно-щелочного равновесия, позволяют планировать дальнейшую тактику диагностики: так метаболический ацидоз служит показанием для проведения газовой хроматографии (ХМС) с целью исключения органических ацидурий, а повышение концентрации ионов аммония — для исключения дефектов цикла мочевины; определение концентрации кетоновых тел и соотношения концентраций лактат/пируватв крови является первым этапом для дифференциальной диагностики митохондриальных болезней.

   Конечно, решающее значение в диагностике  нарушений обмена играют более сложные  и высокоточные количественные методы, такие как флуориметрические, хроматомасе-спектрометрия, спектрофотометрия, различные виды хроматографии и электрофорез гликозаминогликанов (ГАГ), Все эти методы можно условно разделить на две группы: методы позволяющие получить спектр какого-либо класса веществ, например аминокислот, и методы для определения концентрации конкретного вещества, например фенилаланина или тирозина (флуориметрический метод). Хроматографические методы, как правило, дают информацию о спектре и количестве веществ.

   Тонкослойная, колоночная и др, виды хроматографии применяются для выделения и очистки анализируемых соединений, а также для получения результатов на полуколичественном уровне. Так, тонкослойную хроматографию используют для выявления дефектов обмена пуринов и пиримидинов, углеводов, аминокислот, олигосахаридов и гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Метод не требует специального дорогостоящего оборудования, интерпретация результатов довольно проста, а стоимость одного анализа невысока, что иногда позволяет использовать этот метод и на первом этапе скрининга. Более того, поскольку тонкослойная хроматография в зависимости от класса используемой аппаратуры может быть качественной, полуколичественной и количественной, она может применяться на разных этапах скрининга.

   Наиболее  точным, но сложным и обладающим малой пропускной способностью (2 анализа в сутки) методом является ионообменная жидкостная хроматография с использованием аминокислотного анализатора.

   Метод высоковольтного электрофореза  с последующей нисходящей хроматографией аминокислот на бумаге дает ту же информацию, но отличается высокой пропускной способностью (30-40 проб в сутки), дешевле, чем ТСХ, но менее чувствителен.

   В последние годы все большее значение приобретают высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и хроматомасс-спектрометрия (ХМС).

   ХМС - комбинированный метод хроматографии и масс-спектрометрии. Он позволяет получать как количественную, так и качественную информацию, например, определять какие вещества, с какой молекулярной массой, присутствуют в анализируемой пробе и в каком количестве. Кроме того, с помощью ХМС можно получить количественную информацию о неразделенных или совместно элюируемых соединениях, что является одним из важных преимуществ этого метода.

   Тандемная масс-спектрометрия (ТМС) - метод, с помощью которого можно количественно оценить 3000 метаболических маркеров разных групп НБО одновременно и охарактеризовать классы веществ и их молекулярную массу. При этом времени для подготовки проб и проведения анализа затрачивается существенно меньше, чем при использовании некоторых выше перечисленных методов, например, при ГХ.

   Таким образом, совершенствование методов  биохимической диагностики позволяет  выявлять и подтверждать все большее  количество нарушений обмена веществ. Классы НБО, диагностируемые с применением  различных биохимических методов анализа, представлены в таблице.

Близнецовый метод. Задачи и методика близнецового метода.

   Близнецовый метод используется для выяснения  наследственной обусловленности признаков  и хорошо демонстрирует взаимоотношения  между генотипом и внешней  средой. С помощью этого метода удалось оценить значимость генетической предрасположенности к многим заболеваниям, пенетрантность, экспрессивность и условия проявления тех или иных видов патологии. Близнецовые данные оказываются полезными для количественной оценки степени генетической детерминированности отдельных признаков, в связи с чем, близнецовый метод можно считать одним из важных методов количественной генетики.

   Таким образом, близнецовый метод, также  как и анализ родословной, позволяет  установить наследственный характер признаков, и это единственный метод, выявляющий соотносительную роль (удельный вес) генетических (наследственных) и средовых факторов в формировании признака. Авторство близнецового метода приписывают Ф.Гальтону (1876), который сформулировал концепцию: «природа» или «воспитание» (Nature or Nurture), и изложил основные положения вопроса в книге «Близнецы, как критерий силы наследственности и среды». Этот метод сыграл очень большую роль в развитии генетики человека, и одно время рассматривался как своеобразная «королевская дорога» в генетическом анализе человека. В последние годы, несмотря на возможности близнецового метода для понимания роли наследственности и среды, он не имеет столь широкого практического применения, как ранее. Это обусловлено появлением более точных современных методик, дающих однозначный ответ относительно генетической предрасположенности к конкретному заболеванию.

   Принцип близнецового метода прост и заключается в сравнении моно- и дизиготных близнецов. Близнецы - потомство, состоящее из одновременно родившихся особей у одноплодных млекопитающих (человека и животных). Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют 100% общих генов, т.е. выявляемые между ними различия не связаны с наследственным фактором. Дизиготные близнецы развиваются из разных яйцеклеток, оплодотворенных разными спермиями. Они имеют 50% общих генов, как обычные сибсы, но, благодаря одновременному рождению и совместному воспитанию имеют общие средовые факторы, следовательно, степень их различия определяется степенью несходства генотипов. Результатом сравнения этих двух групп близнецов является расчет показателей соответствия (конкордантности) и несоответствия (дискордантности), а также вычисление частоты возникновения заболевания /признака в каждой группе близнецов.