Механизм и теория окраски по Граму

Петрозаводский  государственный университет

Эколого-биологический  факультет 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Реферат по предмету Микробиология

«Механизм и теория окраски по Граму» 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Выполнила: студентка 3 курса ЭБФ

Гр.  31303(6)

Фёдорова  Алина Петровна

Руководитель: Сидорова Наталья Анатольевна 
 
 
 
 
 
 
 

Петрозаводск

2009

Теория

     Открытие, случайно сделанное более 100 лет  назад(1884 год) датским физиком Кристианом Грамом, до настоящего времени остается одним из наиболее важных дифференциальных критериев в идентификации бактерий. Несмотря на относительную простоту постановки методики окраски, с одной стороны, и не совсем полную ясность ее механизма, с другой, окраска по Граму в подавляющем большинстве случаев достаточно четко дифференцирует две давно разделившиеся эволюционно ветви бактерий - грамположительные и грамотрицательные.

     Возбудитель Neisseria gonorrhoeae - типичный представитель  грамотрицательных бактерий, который  в отличие от большинства другой кокковой флоры теряет комплекс основной краситель - протрава в процессе окраски и приобретает красный (грамотрицательный) цвет. В связи с этим определение грампринадлежности - наиболее важный дифференциальный тест при бактериоскопической и культуральной диагностике гонореи.

     Вероятно, мало кому известно, что оригинальная окраска по Граму и общепринятая окраска по Граму - понятия неравнозначные. В том виде, в котором окраска была предложена первоначально, сейчас она практически нигде не используется. В оригинальной прописи комбинация красителей и этапы выглядят таким образом: в качестве основного красителя используется генциановый фиолетовый, протравы - йодный раствор, для обесцвечивания - абсолютный спирт, для дополнительной окраски - везувин, на всех этапах для промывания препаратов рекомендуется анилиновая вода.

     В настоящее время «оригинальная» методика несколько упрощена и изменена. Оказалось, что не обязательно нужен для обесцвечивания препаратов абсолютный этанол, его вполне можно заменить 96% спиртом или ацетоном. Аналогично, нет необходимости в анилиновой воде, для этого сейчас обычно практикуют водопроводную. Вместо генцианового фиолетового и везувина стали почти повсеместно использовать кристаллический фиолетовый или метиленовый фиолетовый (основные красители) и нейтральный красный, реже фуксин (дополнительные красители). Единственное, что неизменно прочно занимает место в методике Грама, это йод, служащий надежной протравой. Его используют обычно в виде водных растворов с йодидом калия (раствор Люголя).

     Следует отметить, что для определения  грампринадлежности бактерий предложены и модифицированные способы, причем число их неуклонно растет. Сейчас насчитывается по крайней мере несколько десятков модификаций, с помощью которых также можно определить отношение бактерий к окраске по Граму. Изменения в модификациях могут касаться комбинации различных основных и дополнительных красителей, использования разнообразных реактивов для протравливания и обесцвечивания, а также изменения количества этапов окраски за счет как их увеличения, так и совмещения.

     В подавляющем большинстве случаев при определении грампринадлежности бактерий неважно, каким способом получают фиолетовую окраску грамположительной флоры и красную грамотрицательной. Нельзя, однако, не отметить, что фиолетовый и красный цвета не являются резко контрастными, и это в ряде случаев, особенно если даже слегка нарушается техника окраски, может приводить к противоречивым и ложным результатам. Известно также, что четкость контраста фиолетовый - красный очень быстро может потеряться при начале старения бактериальных культур или под воздействием небольших доз антибиотиков. Такая грамвариабельность крайне нежелательна при микроскопической и культуральной диагностике гонореи, и с этим связаны достаточно строгая регламентация порядка окраски по Граму, недопустимость каких-либо отступлений от методики в лабораториях кожно-венерологических учреждений. В частности, при диагностике гонореи нежелательно использование для дополнительной окраски препаратов фуксина, который дает красно-фиолетовый оттенок и часто затрудняет интерпретацию результатов, а предпочтение отдают нейтральному красному или сафранину, имеющим оранжевый оттенок.

     Возможно, не все знают, что в качестве основного  красителя помимо фиолетовых (кристаллический  фиолетовый, метиленовый фиолетовый, генциановый фиолетовый) можно с успехом использовать, например, бриллиантовый зеленый. Он предложен, в частности, в модификации Г.П. Калины, при которой грамположительные бактерии приобретают зеленую окраску, а грамотрицательные - светло-розовую. Получение сочетания цветов зеленый - красный более удачно в смысле контрастности, однако это не всегда удается. Например, такие дополнительные красители, как фуксин или нейтральный красный, особенно при длительной экспозиции, оказывают влияние на цвет основного (зеленого) красителя, что ведет к эволюции основной окраски от бирюзовой до фиолетовой. Грамположительные и грамотрицательные бактерии в этом случае утрачивают резкую контрастность. При малой же экспозиции получается очень бледная окраска, что затрудняет изучение грамотрицательных бактерий.

Таким образом, Метод Грама — метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки.

Механизм

     Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

     Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

     Подготовка  материала для  окраски.

Исследуемый материал распределяют тонким слоем  по поверхности хорошо обезжиренного  предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

     Фиксация

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности  предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический  способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80 °С).

Химический  способ фиксации. Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе.

     Процесс окрашивания мазков. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1—2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20—40—60 секунд).Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.