Иммуноферментная диагностика вирусных гепатитов

Общие принципы иммуноферментного анализа.

В основе метода ИФА лежит  следующий принцип: на твердофазном носителе (в отечественных тест-системах и в большинстве тест-систем зарубежного  производства в качестве носителя используется поверхность лунок полистиролового планшета) фиксируется антиген возбудителя инфекции, антитела к которому необходимо выявить. Антиген, иммобилизованный на поверхности твёрдого носителя, принято называть иммуносорбентом. Как правило, в состав набора тест-системы входит уже готовый им-муносорбент. Схема иммунологической реакции, которая происходит в лунках планшета при проведении анализа, представлена на рис. 1. В ходе инкубации иммуносорбента с испытуемой сывороткой при наличии в ней антител к данному антигену происходит их связывание в комплекс «антиген-антитело». После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов следует инкубация с мечеными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека

Внесение образца     Внесение конъюгата 

Рис. 1. Схема иммуноферментного  анализа на иммуноглобулины класса С (!д<3).

1  - носитель (поверхность  лунки планшета);

2  - антиген;

3  - специфические IgG сыворотки крови;

4 - моноклональные анти- IgG -антитела, меченые пероксидазой хрена (конъюгат).

(конъюгатом), в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам «антиген—антитело» антител, меченых ферментом (в качестве фермента чаще всего используется пероксидаза хрена). После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител (в случае использования пероксидазного конъюгата в качестве субстрата применяют перекись водорода в сочетании тетраметилбензидином(ТМБ)). Результат реакции оценивается спектрофотометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки. Некоторые иммуноферментные тест-системы допускают визуальную оценку результатов, что может быть полезно при отсутствии соответствующего оборудования.

Конъюгат, применяемый в таких тест-системах, может быть получен на основе поликлональных антивидовых антител (например, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или на основе поли- или монокловальных антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определённого класса (М,G , А). В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или любые специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса (например, только IgM  или только IgG).

По такому принципу построена  основная масса отечественных ИФА-тест-систем для диагностики различных инфекций ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и др. инфекции.В то же время, существуют тест-системы, в которых использована несколько другая схема (рис. 2) - ИФА с фиксированными антителами или «ловушка для антител» (Antibody capture ELISA). Она основана на том, что на твердофазном носителе фиксируются аффинно очищенные антитела, специфически реагирующие с человеческими антителами определенного класса (IgG,IgM или IgA). В результате инкубации с тестируемой сывороткой антитела этого класса связываются с носителем. Наличие среди них антител, специфических для какого-либо антигена, выявляется в ходе инкубации с этим антигеном, меченым ферментом. При инкубации с субстратом в том случае, когда в исследуемом образце присутствовали специфические антитела, развивается окрашивание раствора. По такой схеме построены, например, коммерческие зарубежные тест-системы «Captia Syph G EIA», «Captia Syph M EIA» для выявления антител, соответственно, классов G и M.

Рис. 2. Схема иммуноферментного  анализа на иммуноглобулины класса М (IgM).

1  - носитель (поверхность  лунки планшета);

2  - моноклинальные анти-IgM-антитела;

3  - IgM сыворотки крови;

4  - антиген, меченый  пероксидазой хрена (конъюгат).

Рис. 3. Схема иммуноферментного  анализа на суммарные антитела.

1  - носитель (поверхность  лунки планшета);

2 - антиген;

3  - специфические IgG;

4 - специфические IgM;

5  - антиген, меченый  пероксидазой хрена (конъюгат).

Третья схема ИФА (рис. 3) используется в некоторых тест-системах для выявления суммарных антител, специфических для определенного антигена, независимо от их класса. Её суть заключается в том, что специфические сывороточные антитела одновременно взаимодействуют с антигеном, зафиксированным на твердофазном носителе, и с тем же антигеном, меченым ферментом, при совместной инкубации сыворотки и конъюгата.

В зависимости от того, какие  антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител  подразделяются на:

•  лизатные — в которых в качестве антигена, иммобилизованного на твердой фазе или входящего в состав конъюгата, используется   нативный   антиген   (лизированный   или   обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

• рекомбинантные - в которых  используются полученные генно-инженерным способом белки — аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;

• пептидные - использующие химически синтезированные фрагменты  белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов - это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

Основными факторами, определяющими  качество лизатной тест-системы, являются антигенная природа возбудителя(например трепонемного  и д.р.) и качество очистки лизата от посторонних примесей. В случае сифилиса первый фактор имеет особое значение. Антигенная природа бледной спирохеты такова, что наряду со специфическими, свойственными только ей, антигенами, существуют и такие, которые гомологичны антигенам других спирохет, антитела к которым могут присутствовать в организме человека. В трепонемном лизате представлены как одни антигены, так и другие, что может послужить причиной ложноположительных результатов при работе с лизатными тест-системами на сифилис. Так как антиген, используемый в таких тест-системах, аналогичен антигену, применяемому в РСК или РИФ, природа получаемых ложноположительных результатов та же, что и в указанных тестах.

Технология получения  рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы  необходимо из всего антигенного  многообразия возбудителя выбрать  антигены, которые отвечали бы следующим  требованиям:

• они должны быть высоко иммуногенными, т.е. в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам в достаточно большом количестве;

•  антитела к этим антигенам  должны присутствовать в определяемых количествах в крови больного в течение всего заболевания;

• эти антигены должны быть высоко специфичными, т.е. характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрестных реакций с антителами другой природы.

Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков.

В идеальном случае (при  выполнении всех указанных требований) возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100% -ной  специфичностью при высокой чувствительности. На практике этого не всегда удаётся  достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100%.

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ.

Основными показателями качества иммуноферментной тест-системы являются:

• чувствительность;

•  специфичность;

•  воспроизводимость.

Чувствительность - доля больных, для которых получен положительный  результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных  больных.

Специфичность - доля здоровых, для которых получен отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных здоровых людей.

Понятия «чувствительность» и «специфичность» тесно связаны с понятиями «ложноотрицательный результат» и «ложнополо-жительный результат».

Ложноотрицательный  результат - отрицательный результат, полученный в данной тест-системе для образца, который на самом деле является положительным.

Л ожноположителъный результат - положительный результат, полученный в данной тест-системе для образца, который на самом деле является отрицательным.

Таким образом, более чувствительной является та тест-система, которая даёт меньше ложноотрицательных результатов, а более специфичной - та, которая даёт меньше ложнополо-жительных результатов.

Чувствительность тест-системы  для диагностики сифилиса оценивают  на некоторой выборке сывороток  крови, взятых от больных, которым достоверно поставлен диагноз «сифилис» (по совокупности клинических данных и  результатов серологических реакций). Чем больше образцов используется, тем точнее оценка данного показателя. Чувствительность тест-системы при  этом рассчитывают по формуле:

 

где Р - количество образцов, давших положительный результат в данной тест-системе; S- общее количество исследованных положительных образцов.

Специфичность тест-системы  оценивается аналогично, но на выборке  сывороток крови здоровых людей. При этом отсутствие возбудителя должно быть подтверждено отрицательными результатами чувствительных серологических тестов .Специфичность рассчитывают по формуле:

где N - количество образцов, давших отрицательный результат  в данной тест-системе; 5 - общее количество исследованных отрицательных образцов.

При оценке специфичности  иммуноферментных тест-систем необходимо иметь в виду их высокую чувствительность. Если при тестировании образцов, составляющих «отрицательную» выборку сывороток, для какого-либо образца получен  положительный результат, прежде чем  посчитать его ложноположительным, необходимо провести дополнительные исследования. Рекомендуется повторить анализ стандартным методом через некоторое время примерно через 1 неделю, примерно через 2 недели и провести дополнительное клиническое обследование пациента.

Воспроизводимость — способность тест-системы давать устойчиво стабильный результат при многократном тестировании одного и того же образца.

При этом имеет значение как  воспроизводимость результата внутри одного планшета (при внесении исследуемого образца в разные лунки), так и воспроизводимость результата при тестировании образца с использованием разных диагностических наборов (одной или разных серий). Воспроизводимость является показателем стабильности качества тест-системы - чем выше данный показатель, тем надёжней тест-система.

Если тест-система используется для качественного анализа (как  скрининговая), то имеет значение лишь воспроизведение «положительного» или «отрицательного» результата, независимо от абсолютной величины получаемой оптической плотности. Оценку воспроизводимости в этом случае осуществляют на некоторой выборке сывороток (чем больше в этой выборке образцов,

дающих слабоположительный и подпороговый отрицательный результат, тем точнее оценка), каждую из которых  тестируют в разных лунках одного планшета и в разных наборах тест-системы. При этом, чтобы получить более правильную оценку, анализ желательно проводить одновременно и «руками» одного лаборанта. Воспроизводимость вычисляют по формуле:

где S - количество использованных образцов, К - число повторов, М - количество невоспроизведённых результатов.

Пример. 10 образцов сыворотки  крови поставлены в 5 повторах. При  этом один слабоположительный образец  в 4 случаях дал положительный  результат, а в 1 случае - отрицательный, и один отрицательный образец  в 3 случаях дал отрицательный  результат, а в 2 случаях — положительный, остальные результаты воспроизвелись все 5 раз. Воспроизводимость тест-системы при этом составит:

Если тест-система используется для определения титра антител (полуколичественный анализ), то становится важным воспроизведение величины титра  антител в данном образце при  его определении в разных наборах  тест-системы (в т.ч. разных серий). Это имеет существенное значение при контроле динамики инфекционного процесса (например, после лечения). В этом случае воспроизводимость можно оценить, определяя титр антител для одного образца в нескольких наборах тест-системы (по крайней мере, в двух).

Таким образом, в каждой диагностической  лаборатории имеется возможность  оценить качество предлагаемых тест-систем и выбрать лучшую для постоянной работы. Рекомендуется также, постоянно  работая с той или иной тест-системой, периодически осуществлять контроль её качества, что повысит надёжность и достоверность получаемых результатов.

Постоянный периодический  контроль качества разрешённых к  производству иммуноферментных тест-систем осуществляет ЦНИКВИ, на который официально возложены функции контролирующей организации.

Список используемой литературы:

1.    Воробьев А.А., Быков А. С., Караулов А.В. Иммунология и аллергология. - М.: Практическая медицина, 2006.

2.    Венгелен-Тайлер В., Бенсон К., Бранч Р.Д. Техническое руководство американской ассоциации банков крови / Пер. с англ. Ю.Н. Токаревой. - М., 2000.

3.    ГОСТ Р 15.013. Медицинские изделия. Система разработки и постановки продукции на производство.

4.    ГОСТ Р 51609-2000. Изделия медицинские. Классификация в зависимости от потенциального риска применения. Общие требования.

5.    Гудер ВТ., Нарайанан С., Виссер Г., Цавта Б. Пробы: от пациента до лаборатории. Влияние факторов преаналитического этапа на качество результатов лабораторных исследований. - М., 2001.