Ферменты клинической диагностики

     Клиническое значение определения  активности КК и ее изоферментов.

     Повышение активности КК в крови может быть следствием травмы, переохлаждения или  перегревания, голодания и бактериальной  интоксикации, дегидратации, поражения электрическим током. Повышенная активность КК-МВ отмечена при мышечной дистрофии разной этиологии, ишемическом рабдомиолизе с миоглобинурией, отравлении угарным газом. Активность КК-МВ повышалась, более чем на порядок превышая норму, у больных острым перикардитом.

     Опыт  применения изоферментной диагностики  в блоке интенсивной терапии  показал, что повышение в крови  активности КК-МВ может происходить  при выраженной недостаточности  кровообращения, катетеризации сердца, отеке легких, аритмиях, кардиогенном шоке, алкогольной интоксикации, кровотечении из ЖКТ, травматической эпилепсии, травме грудной клетки. Активность КК-МВ повышена в крови пациентов при синдроме шока, развившемся при анемии, гиперкапнии, гипоксемии, молочнокислом ацидозе, выраженной гипотонии. Однако только в редких случаях в указанных ситуациях активность КК-МВ на 6% превышала активность КК. Учитывая возможности неспецифического повышения активности КК-МВ, надо помнить и о возможности пропустить небольшой инфаркт миокарда. У больных с гипертрофией миокарда активность КК-МВ в период инфаркта может достигать 1/3 активности КК.

     Повышение активности КК в сыворотке крови  может быть обусловлено увеличением  активности изофермента КК-ММ. Активность КК-ММ в сыворотке крови повышается при прогрессирующей мышечной дистрофии, дерматомиозите, полимиозите, инфаркте миокарда, гипотиреозе, некоторых заболеваниях нервной системы. Активность КК-ММ увеличивается также после физической нагрузки, внутримышечных инъекций, хирургических операций. При мышечной дистрофии типа Дюшенна (наследственном, связанным с полом рецессивном заболевании) активность КК-ММ увеличивается в 8-90 раз по сравнению с нормой, активность изофермента увеличена также у носителей этого гена.

     Активность  КК-ВВ в крови отмечали во время аортокоронарного шунтирования. Полагают, что активность КК-ВВ может быть тестом аноксии тканей. Активность КК-ВВ в крови может также быть следствием гипоксического повреждения мозга, особенно в условиях перинатальной гипоксии. Активность КК-ВВ увеличена у 53% новорожденных с асфиксией. КК-ВВ присутствует в гладкой мускулатуре, но не определяется в сыворотке крови лиц с доброкачественными заболеваниями этих тканей. Одним из возможных объяснений повышения активности КК-ВВ в крови при сосудистых операциях служит предположение, что стенки вен, как, впрочем, и аорты, содержат только одну изоформу КК, а именно КК-ВВ. Активность изофермента КК-ВВ может быть повышена в крови при раке предстательной железы, мелкоклеточном раке легкого, аденокарциноме желудка, лейкозах, хронической почечной недостаточности, передозировке миорелаксантов. Метастазирование рака предстательной железы сопровождается особенно высокими цифрами активности КК-ВВ в крови. Исследователи сходятся во мнении, что активность КК-ВВ может быть использована как неспецифический маркер опухолевого процесса.

     В ряде случаев при инфаркте миокарда, а иногда и в его отсутствие высокая активность КК сохраняется  неопределенно долго. Наблюдаемые  явления обусловлены циркуляцией  в крови необычных форм КК и  ее изоферментов. После разделения при ЭФ фракций КК на электрофореграмме становятся видимыми полосы, не соответствующие положению полос КК-ММ, КК-МВ и КК-ВВ, и можно отметить наличие изоформ КК, движущихся к катоду, что из белков сыворотки крови свойственно иммуноглобулинам. Известно, что окисление сульфгидрильных групп КК изменяет электрофоретическую подвижность молекул, однако при этом они по-прежнему движутся к аноду. У больных метастазирующим раком предстательной железы выделен изофермент КК, мигрирующий между КК-МВ и КК-ВВ. 

     3.6. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) 

     Лактатдегидрогеназа (ЛДГ; L-лактат-НАД-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27) - цинксодержаший фермент, катализирует обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную кислоту при участии НАД-Н₂.

     Фермент в кристаллической форме был получен из мышцы сердца. Подобным же образом были получены кристаллические ферментные препараты из скелетных мышц и печени. При рН 7,0 равновесие реакции смещено в сторону образования лактата, в щелочной среде реакция проходит в обратном направлении. ЛДГ может также реагировать с НАДФ в качестве кофермента, но значительно медленнее, чем с НАД.

     ЛДГ - тетрамер; два локуса генов кодируют синтез двух олигомеров — М- и Н-субъединиц. М-субъединица синтезируется главным  образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как Н-субъединица присутствует в тканях с преобладанием аэробных процессов. Молекулярная масса каждой субъединицы составляет 35 кДа, каждого тетрамера - 140 кДа. Полипептидная цепь обеих субъединиц содержит 330 аминокислотных остатков; различия в их последовательности в субъединицах обнаружены на протяжении более чем 25% длины полипептидной цепи. В тетрамерной структуре ЛДГ субъединицы связаны силами ионных и водородных взаимодействий. На каждой субъединице расположен каталитический центр; диссоциация тетрамера на димеры или мономеры приводит к потере ферментативной активности.

     В цитоплазме клеток и сыворотке крови  ЛДГ имеет 5 изоферментов, обозначаемых в соответствии с их подвижностью к аноду в электрическом поле: ЛДГ₁ (НННН), ЛДГ₂ (НННМ), ЛДГ₃, (ННММ), ЛДГ₄ (НМММ) и ЛДГ₅ (ММММ). ЛДГ, участвует в окислении лактата в пируват в тканях с аэробным типом метаболизма (миокард, мозг, почки, эритроциты, тромбоциты). ЛДГ₅ оптимизирована природой для превращения пирувата в лактат в тканях с высоким уровнем гликолиза (скелетные мышцы, печень). Не все изоферменты ЛДГ гомогенны: при электрофоретическом разделении изоферментов ЛДГ сыворотки и эритроцитов в полиакриламидном геле обнаружено расщепление ЛДГ₃ на две полосы, которое позволяет предположить синтез двух форм ЛДГ₃ в тканях. Наличие молекулярных структур двух форм, подтвержденное в реакции с антисывороткой, объясняют различием пространственного (цис и транс) расположения Н-субъединиц и М-субъединиц в тетрамере.

     В тканях человека активность ЛДГ на 1 г сухой массы уменьшается в последовательности: почки - скелетная мышца – поджелудочная железа — селезенка — печень — плацента. Изоферменты ЛДГ, и ЛДГ₂ преобладают в эритроцитах, лейкоцитах, миокарде, почках, ЛДГ₄ и ЛДГ₅ — в печени, скелетных мышцах, неопластических тканях, наиболее высокое содержание ЛДГ₃ отмечают в лимфоидной ткани, тромбоцитах и опухолях.

     Свойства  изоферментов ЛДГ определены особенностями  входящих в них субъединиц. Изоферментам ЛДГ присущи разные кинетические характеристики: рН, при котором они проявляют максимальную активность, сродство к субстратам и кофакторам.

     Клиническое значение определения  активности ЛДГ

     Активность  ЛДГ в сыворотке крови повышается при многих патологических состояниях, поэтому для дифференциальной диагностики заболеваний более целесообразно исследовать изменения спектра изоферментов ЛДГ. В настоящее время накоплено большое количество данных о распределении изоферментов ЛДГ в тканях и об изменении спектра изоферментов ЛДГ в сыворотке крови при различных заболеваниях. Изоферментный спектр скелетной мускулатуры показывает преобладание ЛДГ₅. При мышечной дистрофии отмечены увеличение более подвижных изоферментов ЛДГ и снижение активности ЛДГ₅, что характерно и для многих нейромышечных заболеваний. Причиной изменения спектра изоферментов может быть быстрое удаление малоподвижных изоферментов из циркуляции. Активность ЛДГ₅ в сыворотке крови — чувствительный индикатор гепатоцеллюлярного поражения, увеличение его активности обычно наблюдают при гепатите, гипоксии печени (включая застой крови в печени вследствие сердечной недостаточности), лекарственной интоксикации, циррозе, опухолях и травме. Активность ЛДГ в сыворотке крови не повышается при хронических заболеваниях почек и уремии, но иногда возрастает после гемодиализа или плазмафереза, что может быть объяснено удалением из крови ингибиторов (мочевина, оксалаты).

     Общая активность ЛДГ при инфаркте миокарда наиболее значительно повышается в  течение первых 2 сут после приступа стенокардии и до исходного уровня понижается медленно, в течение 14-16 дней, эпизодическое повышение ЛДГ  можно отметить и в более поздние  сроки.

     Активность  ЛДГ подвержена гормональному влиянию. Большие дозы тироксина снижали  синтез фермента, при этом в большей  мере отмечено ингибирование синтеза  субъединицы М. Норадреналин и адреналин  вызывают увеличение общей активности ЛДГ с преобладанием активности ЛДГ₁, и ЛДГ₂. Активность фермента в крови возрастает при действии анаболических стероидов и этанола, а также ряда медикаментозных препаратов — клофибрата, кофеина, сульфаниламидов и др.

     Спектр  изоферментов ЛДГ может меняться при неопластических процессах. В таких случаях его трудно интерпретировать, так как источником изоферментов ЛДГ служит не только неопластическая ткань, но и ткани, разрушаемые метастазами. Однако изоферментный спектр транссудатов при опухолевом поражении сходен с таковым сыворотки крови, тогда как в воспалительных экссудатах преобладает активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂. Для ЛДГ, как и для других ферментов, при опухолевом процессе характерен синтез изоферментов, свойственных эмбриональным тканям. Недифференцированные эмбриональные ткани имеют спектр изоферментов ЛДГ, в котором преобладают ЛДГ₂ и ЛДГ₃, а также ЛДГ₄. В злокачественных опухолях обнаружено три вида распределения изоферментов ЛДГ. Увеличение содержания ЛДГ₄ и ЛДГ₅ выявлено при опухолях предстательной железы, матки, молочных желез, желудка, толстой кишки, мочевого пузыря и некоторых типах опухолей мозга. У больных лейкозом, злокачественной лимфомой, нейробластомой, феохромоцитомой, а также при опухолях полости рта, раке бронхов и некоторых типах опухолей мозга увеличена активность ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄. Увеличение активности ЛДГ, отмечено в сыворотке крови больных с некоторыми типами опухолей мозга и разными типами опухолей половых органов.

     Возможность повышения активности ЛДГ, при опухолевом процессе следует учитывать при  диагностике инфаркта миокарда. Иногда при опухолях мозга, раке пишевода, нейробластоме отмечают необычную дополнительную полосу при ЭФ сыворотки крови и ткани опухоли. Определение спектра изоферментов ЛДГ в сыворотке крови при онкологических заболеваниях полезно не только для диагностики, но и для контроля эффективности лечения. Обнаружено, что нормализация спектра изоферментов ЛДГ коррелирует с успешностью ответа больного на лечение.

     Наличие осложнений при инфаркте миокарда и  сопутствующие заболевания могут  изменить спектр ЛДГ и активность ЛДГ. Выявление спектра изоферментов, характерного для инфаркта миокарда, возможно при застое крови в печени и почках вследствие сердечной недостаточности, при ишемическом поражении некоторых органов из-за резкого снижения сердечного выброса. При эмболии легочной артерии, которую в ряде случаев приходится дифференцировать с инфарктом миокарда, увеличение в крови активности ЛДГ₂ и ЛДГ₃ может быть объяснено выходом ферментов из тромбоцитов, патологией печени, вызванной венозной гипертензией, анемией коркового слоя надпочечников и почек. Поскольку эти нарушения не всегда удается различить, изменение спектра изоферментов ЛДГ интерпретировать непросто.

     В сыворотке крови тяжелобольных (как  правило, в терминальном состоянии) методом ЭФ на ацетате целлюлозы выявляется дополнительная полоса, более близкая к катоду, чем ЛДГ₅, названная ЛДГ₆. Во всех наблюдениях в тканях печени, скелетных мышцах, почке, селезенке и надпочечниках также отмечено присутствие ЛДГ₆; в ряде случаев появление этой фракции носило транзиторный характер, ЛДГ₆ не обнаружена в тканях миокарда. Считают, что нет нозологической формы заболевания, для которой характерна ЛДГ₆, но есть тяжелые клинические состояния, обусловливающие ее появление, к которым следует отнести выраженный ацидоз, гипотонию и сепсис. 

     3.7.Щелочная фосфатаза (ЩФ) 

     Щелочная  фосфатаза (ЩФ) - фосфогидролаза моноэфиров орто-фосфорной кислоты (КФ 3.1.3.1) - гидролизует  разные синтетические субстраты  при оптимуме рН, равном 10,0; субстрат фермента in vivo точно не известен. ЩФ - гликопротеин; по структуре это димер с кажущейся значительной вариацией молекулярной массы фермента в разных тканях. ЩФ - металло-фермент, в состав активного центра фермента входит атом цинка. Полагают, что атом цинка повышает активность фермента, обеспечивая конформационные изменения и гидролиз моноэфиров ортофосфорной кислоты. Каждый мономер ЩФ содержит три металлосвязывающих центра. Лишенный ионов цинка фермент теряет активность, но восстанавливает ее после добавления металла. Активность фермента возрастает в присутствии ионов магния, для оптимальной активности необходимо определенное соотношение ионов магния и цинка.

     ЩФ  присутствует во всех органах человека; наиболее высокая удельная активность фермента обнаружена в эпителии тонкой кишки, эпителии канальцев почек, остеобластах, гепатоцитах и плаценте- фермент плотно связан с клеточной мембраной гидрофобным карбоксильным концом полипептидной цепи; гидрофобный конец цепи идентичен у всех изоферментов ЩФ. ЩФ прикреплена к плазматической мембране с помощью фосфатидилинозитолгликанового якоря. Молекулы ЩФ на поверхности плазматической мембраны располагаются неравномерно.

     Молекулярная  масса ЩФ составляет 130-220 кДа. Ассоциация ЩФ с гликозаминогликанами (нейраминовой кислотой) может изменить не только молекулярную массу фермента, но и заряд молекулы и ее подвижность в электрическом поле. Степень гликозилирования ЩФ в тканях может влиять на ее термолабильность.

     В организме человека биосинтез фермента кодируют три гена: один — печеночный, костный и почечный изоферменты, другой — кишечный изофермент и третий — плацентарную ЩФ. Полагают, что существует и 4-й ген, кодирующий синтез зародышевой ЩФ. Последняя локализована в тонкой кишке плода примерно до 30 недель беременности. Эмбриональные и зрелые формы ЩФ сходны по каталитической активности. Выделение ЩФ из ткани печени с помощью фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы приводит к образованию форм, сходных с присутствующими в сыворотке крови. Эти данные позволяют считать, что формы ЩФ сыворотки крови образуются путем ферментативного гидролиза тканевых форм.