Картоп фитофторозының қоздырғышын дала алқаптарында және сақтауда б-эндотоксин Bacillus thuringiensis қатынасындағы антифунгальдық әрекеті

Картоп фитофторозының қоздырғышын дала алқаптарында және сақтауда б-эндотоксин Bacillus thuringiensis қатынасындағы антифунгальдық әрекеті.

Л.К. КАМЕНЕК, Т.А. САТАРОВА, Д.В. КАМЕНЕК, М.А. ТЕРПИЛОВСКИЙ

Бұл тәжірибеде дала алқаптарындағы картоптың Невалық  сортын, сонымен бірге картоптың  Ресурс және Ильиндік сорттарының түйнектерінің  сақтауында және фитофтороздың таралу дәрежесін, өсімдіктің және оның түйнектерінің  әр түрлі б-эндотоксин мөлшерлермен залалдану дәрежесін анықтап, үйреншікті химиялық дәрі-дәрмектермен (метамил, ридомил, максим) салыстырды.

Қысқаша әдістемесі. Бұл тәжірибеге Бүкілресейлік НИИ-дің микроорганизмдердің гентикасы мен селекциясының мәдениеті және Казан мемлекеттік университетінің микробиология кафедрасының топтамасы (картоп және қызанақ фитофторозын қоздырушылар) пайдаланылды.

Осы тәжірибені Ресей Федерациясы, Ульяновск облысы, Охотничий ауылындағы картоп өсірудегі  биологиялық станцияда (2004 - 2007 ж.ж.) жасалынды. Картопты екі қатар аралығы 70 см, ал қатардағы екі өсімдіктің аралығы 30-35 см-дей етіп егілді; бұл тәжірибе 6 мәрте қайталанды. Фунгицидтің орнына d-эндотоксиннің (1%) натрий хлоридімен қоспасы, сонымен бірге метамил және ридомил химиялық аппараттары қолданылды. Өсімдіктерді бүрлеуді аяқтағаннан кейін Titan 12 («Marolex», Польша) бүріккішін пайдаланды. 3, 7, 10, 14 тәулік бүркуден кейін сау және ауру өсімдіктерді санады. Картоп өсімдігінің залалдану дәрежесі 5 – баллдық көрсеткішпен есептелінді. Аурудың даму дәрежесін мына формуламен:

Ал аурудың  таралуын төмеңгі формуламен анықтады:

Қорытындылай  келетін болсақ, б-эндотоксин метамил  мен ридомилге қарағанда тиімдірек  және де б-эндотоксин адам өміріне және жануарларға ешқандай кері әсерін тигізбейді.

АНТИФУНГАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ δ-ЭНДОТОКСИНА Bacillus thuringiensis В ОТНОШЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА КАРТОФЕЛЯ В ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ И ПРИ ХРАНЕНИИ

Л.К. КАМЕНЕК, Т.А. САТАРОВА, Д.В. КАМЕНЕК, М.А. ТЕРПИЛОВСКИЙ

На растениях  картофеля сорта Невский в  полевых условиях (естественный инфекционный фон), а также при хранении клубней  картофеля сортов Ресурс и Ильинский  определяли степень распространения  фитофтороза и степень поражения  растений и клубней при обработке  разными дозами δ-эндотоксина, выделенного из Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, по сравнению с использованием стандартных химических препаратов (метамил, ридомил, максим).

Ключевые слова: биологическая защита растений, фитофтороз, антифунгальное действие, δ-эндотоксины Bacillus thuringiensis.

Фитофтороз  относят к числу наиболее вредоносных  болезней картофеля. Возбудитель заболевания  — гриб Phytophthora infestans (класс Oomycetes), широко распространенный в условиях умеренного пояса. Патоген поражает листья, стебли, клубни, ростки картофеля. Ущерб усугубляется тем, что зараженные клубни при хранении сгнивают (потери урожая при эпифитотиях достигают 50-70 %).

Популяции гриба  высоколабильны, неоднородны и состоят из различных по вирулентности рас. В силу этого, во-первых, возникают трудности при селекции устойчивых сортов картофеля, во-вторых, требуется применение фунгицидов, уменьшающих зараженность и гарантирующих получение удовлетворительного урожая даже в благоприятные для развития болезни годы, что приводит к накоплению в почве и клубнях остатков вредных для человека химических веществ. Очевидна необходимость разработки альтернативных методов борьбы с фитопатогенными грибами, минимизирующих вред, наносимый окружающей среде. Такой альтернативой служит биологический метод, основанный на применении микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.

δ-Эндотоксины  относятся к семейству гомологичных полипептидов, входящих в состав параспоральных включений (кристаллов), продуцируемых многочисленными подвидами бактерии Bacillus thuringiensis Berliner (1). δ-Эндотоксины привлекают внимание исследователей благодаря эффективному высокоспецифичному действию на насекомых. Описан комплекс патологических изменений клеток, происходящих в результате воздействия этих соединений (2). Однако в последние годы, помимо инсектицидного эффекта δ-эндотоксинов, установлены их антибактериальные и антифунгальные свойства (3-5). Так, показана перспективность использования δ-эндотоксинов B. thuringiensissubsp.kurstaki при подавлении слизистого бактериоза капусты, корневых гнилей злаковых культур, бурого бактериоза овса (6, 7). В то же время данных о воздействии δ-эндотоксинов B. thuringiensis на патогенные грибы, в частности на грибы рода Phytophthora, вызывающие опасные заболевания растений, недостаточно.

Целью нашей  работы была оценка фитозащитных свойств d-эндо-токсина Bacillus thuringiensis и изучение особенностей его действия на возбудителя фитофтороза картофеля.

Методика. Использовались культура В. thuringiensissubsp.thuringiensis (штамм 202), полученная из Всероссийского НИИ генетики и селекции микроорганизмов (г. Москва) и P. infestans(Mont.) de Bary штамм 3 (возбудитель фитофтороза картофеля и томатов) из коллекции кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

B. thuringiensis культивировали на агаризованной питательной среде РПА (рН 7,2-7,5) при температуре 27 °С. Фитопатогенные грибы выращивали на картофельно-глюкозном агаре (рН 6,6) при температуре 28 °С. Биомассу B. thuringiensis, содержащую кристаллы эндотоксинов и споры продуцента, отмывали дистиллированной водой от компонентов питательной среды и водорастворимых токсинов, осаждая споры и кристаллы центрифугированием. Степень очистки спорокристаллических комплексов оценивали при помощи световой микроскопии. Кристаллы отделяли от спор последовательной флотацией и экстракцией в двухфазной системе хлороформ—водный раствор Na₂SO₄. Щелочной гидролиз кристаллов проводили по методу K.E. Cooksey (8), полученный раствор диализировали против 0,04 н. раствора NaOH и разбавляли водой до необходимой концентрации (рН раствора снижали до 7,8 осторожным титрованием 0,1 н. HCl). Полученные таким образом препараты были свободны от компонентов культуральной жидкости, включая экзотоксины и экзоферменты бактерий.

Влияние δ-эндотоксина B. thuringiensis на степень поражения фитофторозом изучали у картофеля сорта Невский на искусственном и естественном инфекционном фоне.

Полевые эксперименты проводили на базе Биологической  станции по выращиванию картофеля (пос. Охотничий, Ульяновская обл.) на фоне традиционной для хозяйства агротехники (применение удобрений, инсектицидов, гербицидов, культивации, прополки и т.д.) в сезоны 2004-2007 годов. В схеме посадки междурядье составляло 70 см, расстояние между растениями в ряду — 30-35 см; повторность опытов — 6-кратная. В качестве фунгицидов использовали смесь d-эндотоксина (1 %) с NaCl (в качестве наполнителя), а также химические препараты метамил (МЦ сп 72 %) и ридомил. Норма расхода препаратов в полевых условиях составляла 60 г/га — для δ-эндотоксина, 100 г/га — для метамила и 750 г/га — для ридомила. Растения (наземные части) обрабатывали в период окончания бутонизации (конец июня) рабочими смесями с помощью ранцевого опрыскивателя Titan 12 («Marolex», Польша). Здоровые и пораженные растения учитывали через 3, 7, 10 и 14 сут после опрыскивания. На контрольных делянках обработки растений фунгицидами не проводили (9).

Степень поражения  растений картофеля оценивали по 5-балльной шкале, отражающей визуально-качественную и количественную характеристики поражения (10). Степень развития болезни (%) рассчитывали по формуле:

, 
где ∑S(a x b) — сумма произведений числа пораженных растений на соответствующий балл развития болезни; H — общее число учетных растений, шт.; К — высший балл шкалы учета.

Распространенность  болезни (%) определяли, как

,

где n — число больных растений в варианте, шт.; Н — общее число учетных растений, шт.

Биологическую эффективность (%) препаратов вычисляли по следующей формуле:

,

где Р_К — показатель развития болезни в контроле; Р_O — показатель развития болезни в опыте.  
Для оценки влияния δ-эндотоксина на развитие фитофтороза при хранении отбирали зрелые клубни картофеля сортов Ресурс и Ильинский без внешних признаков поражения фитофторозом (естественный инфекционный фон) (50 шт. в каждой из 4 повторностей варианта). Клубни содержали в условиях стационарного хранилища в ящиках при 1-3 °C и относительной влажности воздуха 85-90 %, диагностируя по визуальным признакам (окончательную идентификацию осуществляли после выделения грибного патогена в чистую культуру). Обработку клубней при хранении проводили раствором δ-эндотоксина из расчета 75 и 150 мг/кг клубней (по действующему веществу — 7,5 и 15,0 мг/кг) и химическим препаратом максим (кс 2,5 %) из расчета 2 мл/кг клубней (по действующему веществу — 10 мг/кг). В контроле вместо препаратов использовали воду. Клубни просушивали на воздухе и укладывали в ящики.

Результаты  подвергали статистической обработке  с помощью пакета программ Microsoft Excel (11).

Результаты. На 3-и сут после начала опытов доля здоровых растений картофеля в контроле составила 22,2 %. Растений с оценкой степени поражения 1 балл оказалось 20,4 %, 2 балла — 22,0 %, 3 балла — 12,5 %, 4 балла — 18,8 % и 5 баллов — 4,2 % (табл. 1).

 Через 7 сут число растений без признаков поражения уменьшилось в 9 раз, тогда как с высоким (от 3 до 5) баллом поражения — увеличилось более чем вдвое, то есть наблюдалось явное развитие фитофтороза. Растений с поражением 3, 4 и 5 баллов стало больше соответственно на 8,0; 11,8 и 31,8 %. 
При применении раствора δ-эндотоксина также отмечали снижение доли непораженных растений, но значительно меньшее, чем в контроле (в 1,7 раза через 3 сут и в 3,2 раза — через 7 сут). Одновременно уменьшалась доля растений с поражением по сравнению с контролем: для 1, 2, 3, 4 и 5 баллов через 3 сут — соответственно на 22,2; 17,5; 11,1; 15,9 и 3,2 %, через 7 сут — на 30,2; 17,5; 20,4; 6,4 и 17,5 %.   
Химический препарат ридомил сдерживал развитие заболевания несколько слабее, чем d-эндотоксин. Так, число здоровых растений через 3 сут оказалось в 1,6 раза больше, чем при обработке δ-эндотоксином, через 7 сут — в 1,9 раза больше. Однако следует отметить, что норма его расхода была значительно выше. У метамила (аналог ридомила) эффект оказался ниже, чем у δ-эндотоксина: доля непораженных растений через 3 сут была в 1,1 раза больше, чем в контроле, через 7 сут — в 1,6 раза больше. Использование метамила позволило значительно сократить лишь число растений с поражением 3 и 4 балла (соответственно до 7,4 и 9,3 % через 3 сут и до 8,3 и 13,8 % через 7 сут) (см. табл. 1). Следует отметить, что обработка растений этим химическим фунгицидом практически не подавляла фитофтороз, и динамика развития болезни была схожа с таковой в контроле.   
Наиболее эффективное сдерживание развития болезни наблюдали при совместном использовании δ-эндотоксина с метамилом. При этом по сравнению с контролем доля непораженных растений возрастала в 3,4 раза через 3 сут и в 2,2 раза — через 7 сут. Полностью отсутствовали растения с 3-5-балльным поражением. Число слабопораженых (1-2 балла) было выше контрольного в 1,3 раза. Снижение доли здоровых растений на 7-е сут относительно 3-х (на 26,2 %) произошло только за счет растений с поражением 1 балл и появления 15,1 % растений со степенью поражения 2 балла. Растений без внешних признаков поражения оказалось в 19,0 раз больше, чем в контроле, и в 11,6 раза — чем при использовании метамила. 
Анализ динамики распространенности болезни (P) свидетельствует, что в контрольной группе на 3-и сут показатель составил 77,8 %, на 7-е — уже 97,4 % (табл. 2), при обработке метамилом — оставался практически на уровне контроля (соответственно 75,0 и 95,8 %,), при использовании δ-эндотоксина — соответственно 61,5 и 91,6 %.