Вплив pН середовища на ферментативну активність

4. Амілаза. Дія  амілази у переробці крохмалю

В основі промислової переробки  крохмалю лежить його гідроліз до цукру  та декстринів. Ферментативний гідроліз крохмалю здійснюється за допомогою амілаз: α-амілази, β-амілази та глюкоамілази.

α-Амілаза (α-1,4-глюкан-глюкангідролаза) – ендофермент, який гідролізує α-1,4-зв*язки у молекулі амілози чи амілопектину, в результаті чого утворюються продукти неповного гідролізу крохмалю –  α-декстрини. Саме тому амілазу називають  декстринуючим ферментом. Вона інтенсивно розріджує крохмальний клейстер, знижуючи його в*язкість. Також амілаза  може діяти на нативний крохмаль, руйнуючи крохмальні зерна. При дії α-амілази  на амілозу можна отримати близько 85% мальтози та 15% глюкози, при дії  на амілопектин – близько 70% мальтози, 10% ізомальтози та 20% глюкози.

α-Амілаза знайдена у тварин (слина, підшлункова залоза), у вищих  рослин (солод), у мікроміцетів (рід Aspergillus, рід Rhizopus) та у бактерій (Bac.subtilis, Bac.diastaticus).

β-Амілаза (α-1,4-глюкан-мальтогідролаза) – екзофермент, що гідролізує α-1,4-зв*язки при нередукуючих кінцях молекул  амілози та амілопектину, при цьому  утворюючи молекули мальтози. При  дії β-амілази на амілозу можна  отримати 100% мальтози, при дії на амілопектин – 60% мальтози та 40% β-амілодекстринів (продукт неповного гідролізу).

β-Амілаза поширена у тканинах вищих рослин, ячмінному солоді, пшениці та соєвих бобах.

Амілази у хлібопекарстві

Основним процесом у технології виготовлення хлібобулочних виробів  є бродіння тіста, викликане дріжджями. Важливу роль у цьому процесі  відіграють амілази. Борошно містить  малу кількість бродильних цукрів, що знижує тривалість бродіння тіста, тому амілази, гідролізуючи крохмаль до бродильних цукрів, неоюхідні для  збільшення періоду бродіння тіста. Активність амілаз у борошні визначає його цукроутворювальну спроможність. Від неї залежить інтенсивність  бродіння тіста, кількість залишкових цукрів у ньому та, зрештою, якість хлібобулочних виробів. Але часто  цукроутворювальна здатність борошна  недостатня (особливо у вищих гатунках), що викликає нестачу цукрів у тісті, утворення малопористої м*якоті. Тому для покращення хлібопекарських властивостей борошна широко використовуються препарати амілаз із мікроміцетів.

В той же час висока активність α-амілази може зіграти негативну  роль при випіканні хліба внаслідок  її дезагрегуючої дії на клейстеризований крохмаль. Таке явище має місце  у випадку переробки борошна  з пророслого зерна, яке містить  високоактивну, термостабільну α-амілазу. Внаслідок цього хліб випікається  з липкою м*якоттю.

 

5. Вплив рН на  активність ферментів

Активність ферментів  залежить від наступних факторів: концентрація фермента і субстрата, температура, рН-середовище, присутність  інгібіторів.

Зміна рН має вплив на іонний стан фермента, а інколи –  і субстрата. Як свідчать виміри ферментативної активності при різних значеннях  рН, оптимум активності знаходиться  між рН 5,0 та 9,0. Разом з тим, окремі ферменти, наприклад пепсин, активні  при рН, яке знаходиться далеко за межами даного інтервалу.

Залежність активності від  рН-середовища залежить від наступних  факторів:

1. Денатурація фермента  при дуже високих чи дуже  низьких рН.

2. Зміна значення заряду  молекул субстрата чи фермента.

Активність фермента може змінюватись внаслідок  змін його структури або заряду функціональних залишків, що приймають участь у  каталізі чи зв*язуванні субстрата. Як приклад розглянемо взаємодію негативно  зарядженого фермента (Enz^--) з позитивно зарядженим субстратом (SH⁺):

Enz^-- + SH⁺ → Enz – SH.

При низьких рН виникає  протонування Enz^--:

Enz^-- + Н⁺ → EnzH,

а при високих рН –  депротонування субстрата:

SH⁺ → S + H⁺.

Оскільки взаємодіяти  між собою можуть тільки SH⁺ і Enz^--, то при граничних значеннях рН ефективна концентрація Enz^-- або SH⁺ , буде низькою, що викликає зниження швидкості реакції.

І тільки в області, яка  виділена подвійною штриховкою, у  потрібному іонному стані одночасно  знаходяться і Enz, і S, а максимальної концентраціїї вони досягають у  точці X.

При зміні рН ферменти зазнають конформаційних змін. Для підтримки  активної третинної або четвертинної структури може бути необхідним присутність  деякого заряду на групі, яка віддалена  від області зв*язування субстрата (наприклад, гемоглобін). Якщо заряд даної групи зміниться, то може відбутись часткова розгортка білкового ланцюга, чи навпаки – компактизація молекули або її дисоціація на протомери.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6. Методика проведення досліду

Принцип методу грунтується  на різному забарвленні розчину  крохмалю йодом, яке залежить від  ступеня його гідролізу амілазою при різних значеннях рН середовища.

Оптимальні значення рН для деяких ферментів
Пепсин	1,5 – 2,2		Мальтаза (дріжджі)	6,7 – 7,2
Каталаза	4,4 – 4,7		Уреаза	7,0
Сахароза (дріжджі)	4,6 – 5,0		Амілаза солоду	4,4 – 4,7
Ліпаза (насіння рицини)	4,7 – 5,0		Трипсин	7,0 – 7,8
Амілаза слини	6,8		Аргіназа	9,5 – 9,9

 

Хід роботи

В конічну колбу на 50 – 100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0%-го розчину  крохмалю і поміщають у термостат  з температурою 30◦C. Загальний об’єм реакційної суміші завжди повинен бути рівний 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, об’єм, кого нестає доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв витримки в термостаті в колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і  точно за секундоміром відмічають час.

За початок реакції  приймають час, коли з піпетки  виллється половина вмісту. Через  кожну хвилину після початку  реакції або частіше скляною  паличкою відбирають краплину суміші і на білій порцеляновій пластинці  з’єднують її з раніше нанесеною  краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане  змінювати забарвлення на синє при  з’єднанні з краплиною дослідної  рідини (протягом перших 10 с).

Час, за який проходить розщеплення  крохмалю до продуктів, що не забарвлюються  йодом, може становити від 3 до 20 хв., але більш надійні результати отримують у межах від 5 до 15 хв. Всі піпетки, які використовуються при аналізі, повинні мати ватні тампони (для запобігання попадання слідів слини).

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв., то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад – 2 мл. У цьому випадку в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 3 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення  забарвлення становить більше 20 хв., то готують розчин ферменту більшої  концентрації, наприклад, 1:50 чи 1:100, а  рідину можна не розбавляти зовсім.

При часі зникнення забарвлення  в межах 3 – 5 хв. Проби відбирають кожні 15 с; 5 – 10 хв. – кожні 30 с; а  більше 10 хв. – кожну хвилину.

Скляну паличку після  кожної проби промивають дистильованою  водою і витирають чистим  не крохмаленим рушником.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7. Розрахунок амілолітичної  активності

Амілолітична активність характеризує здатність ферментів  каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом. Метод  характеризує активність α-амілази, але  при наявності в препараті  β-амілази і глюкоамілази цим  методом визначають сумарну дію  всіх амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної  активності прийнято таку кількість  ферменту, яка каталізує розщеплення  1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом за 1 год при 30°С у чітко визначених умовах.

Амілолітичну здатність  препарату (АЗ) виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує, скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватися йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Розрахунок амілолітичної  активності (амілолітичної здатності  – А3)

Розрахунок АЗ проводиться  за формулою:

                                          АЗ = =

де 0,2 – кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 – коефіцієнт перерахунку на 1 год; а – кількість  ферментного препарату, введеного  в реакційну суміш у грамах абсолютно сухої речовини або  мілілітрах рідинного об’єкта; t –  час, за який пройшло розщеплення  крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв; 1 – перерахунок  на 1 г абсолютно сухого препарату  або 1 мл розчину. Для аналізу беруть 10 мл ферментного розчину з розбавленням 1:1000.

 

 

 

Значення pH	τ,хв.	АЗ
2	37	32,43
4,7	3	400
7	4	300
11	60	20

Таблиця даних

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8. Графік залежності  активності ферменту від рН

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

9. Висновок

У ході проведеної науково-дослідної  роботи, ми візуально спостерігали вплив рН середовища на дію ферментів, в нашому випадку дію амілази  на високомолекулярний полісахарид  крохмаль. Для кожного ферменту існує оптимальне значення pH. Незначне відхилення pH від оптимального значення уповільнює або зупиняє дію ферментів.

За результатами досліджень було підтверджено, що значення рН для  ферменту амілази, при якому він  проявляє найбільшу активність є  рН 4,7 – це оптимальне значення рН для  даного ферменту.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10. Література

1. Жеребцов Н.А., Попова  Т.Н., Артюхов В.Г. Биохимия: Учебник.  – Воронеж: Издательство Воронежского  государственного университета. 2002. – 696 с.

2. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В  2-х томах. Т.1. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1993. – 384 с., ил.

3. Губський Ю.І. Біологічна  хімія. Підручник. – Київ –  Вінниця: НОВА КНИГА, 2007. – 656 с., Іл.

4. Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая  химия. Химические подходы к  механизму действия ферментов:  Пер. с англ. – М.: Мир, 1983. –  512 с., ил.

5. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д.  Биологическая химия: Учеб. для  хим., биол. и мед. спец. вузов. –  3-е изд., испр. – М.: Высш. шк., 2000. –  479 с.

6. Практикум з біохімії для студентів технологічних спеціальностей денної форми навчання. Частина 1 / Укладачі: Г.О. Нікітін, А.І. Салюк, О.І. Семенова, Н.В. Левітіна, В.В. Жовнірський, А.В. Котинський – К.: НУХТ, 2004. – 101 с.