Технология микробиологических объектов

     Технология  микробиологических процессов

     Для того чтобы получить некоторое представление  о различных практических аспектах расчета и эксплуатации биореакторов, а также об осуществляемых в них процессах, рассмотрим ряд вопросов, связанных с промышленным применением микробиологических реакторов (которые по традиции часто называют ферментерами). Основное внимание мы будем уделять типичным материалам и методам, используемым в периодических процессах. В завершающей части этого раздела мы изучим некоторые альтернативные конструкции реакторов, разработанные для лабораторных и пилотных установок и в некоторых случаях успешно перенесенные на крупномасштабные промышленные установки.

     На  рис. 9.34 представлена схема важнейших  этапов типичного микробиологического процесса. Ранее мы уже упоминали о подходах к выбору соответствующей среды (разд. 7.1.2), способах ее стерилизации (разд. 9.4) и различных газах, применяющихся в таких процессах. 

     В следующем разделе мы дадим дополнительные сведения о подборе состава среды. Хотя мы уже обсуждали некоторые  стороны влияния природы посевного  материала на ход процесса, ряд  проблем микробиологического

     характера, связанных с введением инокулята в среду, целесообразно несколько детальнее рассмотреть и здесь. Разд. 9.7.2 посвящен изучению конструкций собственно ферментеров. 
 
 
 

     Подбор  состава среды 

     При подборе необходимого для определенного  микробиологического процесса состава среды следует принимать во внимание множество факторов. Один из них связан со стехиометрией клеточного роста и количеством биомассы, которое мы хотели бы получить по завершении процесса. Основой любых расчетов здесь является простой материальный баланс, связанный с превращением в процессе клеточного роста низкомолекулярных органических и неорганических соединений, например глюкозы и аммиака, в биомассу. Для синтеза заданного количества биомассы (продукта процесса) в систему необходимо ввести достаточное количество питательных веществ (реагентов), взятых в определенном соотношении. Очевидно, что для расчета требующегося количества различных субстратов необходимо знать элементный состав продукта (биомассы). Примеры элементного состава ряда микроорганизмов приведены в табл. 5.10. В среде должны присутствовать и необходимые неорганические вещества (табл. 9.12).

     Если  требования к элементному составу  питательных веществ определены, то мы должны далее выбрать конкретные соединения, содержащие необходимые для клеточного роста элементы. Многие из применяемых в промышленности микроорганизмов являются хемогетеротрофами, потребности которых в энергии и углероде удовлетворяются простыми сахарами. В промышленности в качестве источников энергии и углерода часто применяют не очищенные сахара, а те или иные полупродукты, например свеклосахарную, тростниково-сахарную или кукурузную мелассу (содержащую от 50 до 70% ферментируемых Сахаров). В некоторых случаях дешевым, но в то же время вполне удовлетворительным источником углерода для микроорганизмов могут служить отходы, например сыворотка или отходы консервного производства. Так, один из видов пищевых дрожжей получают в промышленном масштабе путем роста культуры на побочном продукте бумажного производства, сульфитно-спиртовой барде, содержащей всего лишь около 2% способных к ферментации гексоз и пентоз.

     К числу доступных источников азота  относятся аммиак, мочевина и нитрат. Вместе с тем микроорганизмы, продуцирующие протеолитические ферменты, могут усваивать азот и из разнообразных смесей, содержащих белки

     Из  потенциально ценных источников такого рода следует упомянуть фильтрат барды, зерно хлебных злаков, пептоны, мясные отходы, соевую муку, казеин, дрожжевые  экстракты, муку из жмыха семян хлопчатника, арахисовый шрот, муку из жмыха льняного семени, кукурузный настой. В производстве пенициллина особенно важен кукурузный настой, представляющий собой концентрированный (50% твердых веществ) водный раствор, образующийся в качестве отхода при замачивании кукурузы в процессах получения крахмала, клейковины и других продуктов.

     В предыдущих главах мы упоминали, что  для нормального роста и жизнедеятельности  некоторых микроорганизмов необходимо наличие в питательной среде определенных аминокислот и факторов роста. Другие микроорганизмы, не столь требовательные к составу среды, тем не менее растут значительно быстрее в присутствии определенных (хотя и не обязательных) факторов роста и источников азота и углерода. Что касается промышленных процессов, то необходимые факторы роста обычно обеспечивает какой-либо из полупродуктов, входящих в состав среды, например кукурузный настой или дрожжевой авто-лизат

     Кроме того, полупродукты часто являются источниками различных минеральных  веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности клеток. Другие минеральные  вещества добавляют в среду по мере необходимости.

     Если  основной целью процесса является синтез продукта жизнедеятельности микроорганизмов, то к среде для повышения выхода или для улучшения качества продукта процесса можно добавлять определенные вещества-предшественники. Обычно молекула предшественника или его близкого производного включается в молекулу продукта. Так, например, в производстве новобиоцина, пенициллина G и витамина В12 в качестве предшественников используют бензойную кислоту, фенилуксус-ную кислоту и 5,6-диметилбензимидазол соответственно. Входящие в состав среды полупродукты также могут содержать полезные вещества-предшественники.

     Более подробные сведения о подборе  состава среды можно найти  в приведенной в конце главы  литературе. Теперь мы можем переключить наше внимание на другие аспекты технологии микробиологических процессов. 

     Проектирование  типичного асептического аэробного  микробиологического процесса и  его ведение 

     Большинство промышленных микробиологических процессов  имеют те или иные общие черты, однако на практике появляются существенно различающиеся проекты процессов и способы их ведения, что часто обусловлено разными требованиями к заражению системы вредными организмами. Если заражение вообще нежелательно, то процесс необходимо вести в асептических условиях при поддержании чистоты культуры. В некоторых случаях, например при росте дрожжей в слабокислой среде или при ферментации углеводородов тщательно подобранными штаммами бактерий, требования к соблюдению асептических условий могут быть несколько снижены, так как условия процесса сами по себе не стимулируют рост многих потенциально вредных микроорганизмов.

     В этом разделе основное внимание будет  уделено способам поддержания асептического  режима, поскольку именно здесь очень  многое зависит от умения и искусства  биохимика-технолога. В нашем обсуждении мы будем придерживаться последовательности операций, принятой в периодическом процессе, и начнем с получения посевного материала (инокулята) из чистой культуры.

     Подготовка  посевного материала сводится к  пролиферации небольшого числа клеток в строго контролируемых условиях до плотной суспензии, объем которой  составляет 1—20% объема промышленного  ферментера. Эта операция выполняется  ступенчато путем постепенного увеличения масштаба. Исходным материалом служит чистая культура-—тщательно поддерживаемая популяция данного штамма микроорганизма. Обычно нужный штамм получают в результате многочисленных экспериментов, включающих выведение множества мутантов, их скрининг и селекцию. Поскольку полученный таким путем штамм микроорганизмов может обладать целым рядом преимуществ, то при хранении необходимо обеспечить неизменность его генетической природы. Обычно генетическая стабильность штамма микроорганизмов достигается за счет максимального снижения его метаболической активности при хранении. Микроорганизмы, как правило, хранят в состоянии покоя в частично обезвоженном виде; обезвоживание осуществляют путем лиофилизации (сублимационной сушки) суспензии клеток в жидкости или путем тщательного высушивания дисперсии спор или клеток в стерильной почве или песке. Склонные к мутациям организмы часто подвержены обратным мутациям или иным нежелательным генетическим изменениям

     В таких случаях важно регулярно контролировать чистоту культуры.

     Если  мы в качестве примера возьмем  лиофилизованную культуру, то следующей стадией процесса получения посевного материала будет приготовление суспензии клеток в стерильной жидкости. Затем каплю этой суспензии переносят на скошенный агар, который приготавливают желатинизацней стерильной питательной среды в наклоненной пробирке с помощью агара — полисахарида, выделяемого из водорослей. После инкубации, обеспечивающей достаточный рост, клетки опять суспендируют в жидкости и наносят на агаровую поверхность большей площади в плоских сосудах Блэйка или Ру или переносят во встряхиваемый сосуд. Эти сосуды затем устанавливают на качалках, обеспечивающих перемешивание за счет вращательного или вращательно-поступательного движения; таким путем достигается рост погруженной культуры, а также адекватное поступление кислорода в культуру и выведение газов из нее. Обычно эту операцию повторяют несколько раз с сосудами все больших объемов и только затем переходят к следующей стадии

     Все описанные операции переноса культуры должны выполняться в строго стерильных условиях. Для осуществления этих тонких операций на предприятиях микробиологической промышленности обычно предусматривают специальные помещения со стерильной атмосферой, асептическими условиями и регулированием  температуры.

     Дальнейшая  пролиферация культуры осуществляется в одном или нескольких сосудах  для посевного материала —  небольших ферментерах, снабженных почти всеми контрольно-измерительными приборами, которые применяются в крупномасштабных процессах. В этих реакторах подбираются такие условия, которые бы обеспечивали максимальную скорость роста культуры.

     На  этой стадии получения посевного  материала мы переходим от лабораторных экспериментов к заводским установкам и условиям. Здесь уместно ознакомиться с некоторыми основными принципами и методами поддержания асептического режима, а также с устройствами и операциями, применяющимися для достижения этой цели. Прежде всего система должна иметь такое устройство, чтобы можно было проводить независимую стерилизацию всех входящих в ее состав узлов и компонентов. В качестве

     примера чрезвычайных мер предосторожности, которые должны предусматриваться в проекте системы и соблюдаться в процессе ее эксплуатации, рассмотрим частную проблему переноса инокулята из сосуда для посевного материала в промышленный реактор. На представленной на рис. 9.35 схеме изображены основные узлы и устройства, а также последовательность операций. Все клапаны системы должны быть доступны для проверки, чистки и стерилизации; по этой причине здесь наиболее популярны шаровые клапаны. Рис. 9.35 дает представление и о некоторых других общих принципах асептического процесса. Особое внимание должно быть обращено на паронепроницаемость всех соединений системы; в системе должны быть 

     РИС. 9.35. Система трубопроводов и запорно-регулирующей арматуры, используемая для асептической инокуляции крупномасштабного ферментера. Последовательность операций: 1) установить участок трубопровода АВ; 2) стерилизовать этот участок паром при давлении 1,055 кг/см2 в течение 20 мин; клапаны D и J открыты, клапан С закрыт, а конденсат собирается в ловушках, расположенных в узлах Я и /; 3) клапаны С, G, Н, 1, J закрыть; клапаны D, Е, F открыть; охладить ферментер под давлением стерильного воздуха, при этом стерильная среда заполняет соединительный трубопровод

     4) в резервуаре для посевного  материала повысить давление  до 0,7 кг/см2, а в ферментере снизить  до 0,14 кг/см2; 5) перевести инокулят в ферментер, открыв клапан С; 6) отключить резервуар для посевного материала и ферментер от системы подачи пара, закрыв вентили F и С; открыть вентили G и /, спустить пар и конденсат, частично открыв вентили D и Е.

     полностью исключены любые контакты между  стерильными и нестерильными  зонами. Поддержание в системе  небольшого избыточного давления способствует тому, что все случайные утечки будут происходить только из системы, а не в обратном направлении.

     На  рис. 9.36 приведен чертеж общего вида (с  указанием основных узлов и размеров) промышленного ферментера, выпускаемого в серийном масштабе. Обычно такие ферментеры, изготавливают из нержавеющей стали, что существенно снижает: возможность коррозии аппаратуры и сводит к минимуму опасность загрязнения культуральной жидкости нежелательными ионами металлов (вспомните приведенные в разд. 5.9.2 данные о влиянии ионов железа на процесс микробиологического синтеза лимонной кислоты).

     Как в самом ферментере, так и в  любых других аппаратах и элементах системы не должно быть застойных зон, щелей, трещин и других участков, в которых могут накапливаться устойчивые к стерилизации твердые вещества и в которых растущие микроорганизмы могут образовывать-плотные скопления и пленки. Решить эти проблемы помогает применение цельносварных конструкций с тщательно зачищенными и отполированными сварными швами.

     Перемешивающее  устройство должно обеспечивать перемешивание и аэрацию системы в той степени, в какой это необходимо (гл. 8). Чтобы исключить возможность заражения культуры, при проектировании и в процессе эксплуатации реакторов--особое внимание следует уделять асептическим уплотнениям. В лабораторных ферментерах обычно достаточно одной лопастной мешалки, а в больших промышленных реакторах могут потребоваться несколько перемешивающих устройств.