Нуклеиновые кислоты

1. Затрагивающие единичные  нуклеотиды: депуринизация; дезаминирование  цитозина до урацила; дезаминирование  аденина до гипоксантина; алкилирование  оснований; вставка или делеция  нуклеотида; включение основания-аналога.

2. Затрагивающие пару  нуклеотидов: УФ-индуцируемое образование  тиминовых димеров; поперечные  сшивки бифункциональным алкилирующим  агентом.

3. Разрывы цепей: ионизирующая  радиация; радиоактивная дезинтеграция  каркаса ДНК.

4. Поперечные сшивки: между основаниями одной цепи  или разных цепей; между ДНК  и молекулами белка (например, гистонами).

Поврежденные участки  могут быть подвергнуты репарации, замещены путем рекомбинации или  остаться без изменений. В последнем  случае возникают мутации, потенциально ведущие к гибели клетки.

Основной путь репарации ДНК включает 3 этапа:

1. Измененный участок  ДНК распознается и удаляется  при помощи ферментов ДНК-репарирующих  эндонуклеаз.

2. ДНК-полимераза I связывается с 3’-концом поврежденной цепи ДНК и заполняет брешь, присоединяя нуклеотиды друг за другом комплементарно неповрежденной цепи ДНК.

3. ДНК-лигаза сшивает  фрагменты ДНК и, тем самым,  завершает восстановление структуры  ДНК. 

4.2. Транскрипция

Синтез РНК на матрице  ДНК называется транскрипцией. Последовательность рибонуклеотидов в молекуле РНК комплементарна последовательности дезоксирибонуклеотидов одной из цепи ДНК. Та из двух цепей ДНК, по которой непосредственно идет транскрипция РНК-молекул, называется кодирующей цепью. Другую цепь называют некодирующей цепью соответствующего гена. Единицей транскрипции является оперон (у прокариот) и транскриптон (у эукариот). По функциональному признаку в опероне выделяют регуляторные и структурные области:

1) промотор - место инициации транскрипции, к которому присоединяется фермент РНК-полимераза;

2) ген-оператор (или акцепторная зона у эукариот) - место связывания регуляторных белков, например, белка-репрессора;

3) структурные гены, включающие информативные участки - экзоны и неинформативные участки - интроны;

4) терминатор - последовательность нуклеотидов, сигнализирующая о завершении транскрипции.

Факторы, необходимые для транскрипции

1. Матрица, которой является неспаренная цепь ДНК.

2. Субстраты. Для синтеза РНК необходимы четыре типа рибонуклеозидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ. Разрыв макроэргической связи между α и β-остатками фосфорной кислоты обеспечивает процесс синтеза энергией.

3. Транскрипция происходит с участием фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

 

Механизм транскрипции

Синтез РНК включает 3 стадии: инициации, элонгации и  терминации.

1. На стадии инициации РНК-полимераза находит промотор и происходит присоединение всей молекулы РНК-полимеразы. Синтезируемые цепи РНК имеют на 5’-конце обычно остаток ГТФ или АТФ (рррА, либо рррГ). В отличие от синтеза ДНК затравка в этом случае не нужна. Следовательно, новообразованная цепь РНК имеет трифосфатную группу на 5’-конце и свободную ОН-группу на 3’-конце.

2. На стадии элонгации РНК полимераза синтезирует цепь РНК в направлении 5’®3’ антипараллельно матричной цепи ДНК. В ходе транскрипции новосинтезированная цепь РНК временно образует короткие отрезки гибридной спирали ДНК-РНК. По мере того, как расплетается очередной участок ДНК, транскрибированный участок восстанавливает свою двуспиральную конформацию. Максимальная скорость элонгации составляет примерно 50 нуклеотидов в секунду.

3. Сигнал терминации синтеза молекулы РНК представляет собой определенную последовательность нуклеотидов, расположенную в рамках кодирующей цепи ДНК. Этот сигнал распознается терминирующим белком - r-фактором. После терминации синтеза данной цепи РНК кор-фермент отделяется от ДНК-матрицы и, может узнавать соответствующие промоторные участки и приступать к синтезу новой молекулы РНК. Одну и ту же кодирующую цепь могут одновременно считывать несколько молекул РНК-полимеразы, но процесс отрегулирован таким образом, что в каждый данный момент каждая молекула транскрибирует различные участки ДНК.

В результате транскрипции образуются три типа предшественников РНК (первичные транскрипты): предшественник мРНК, или гетерогенная ядерная РНК (пре-мРНК или гяРНК), предшественники рРНК (прерРНК), содержащие 5,8S РНК, 18S РНК и 28S РНК у эукариот и, соответственно 5S, 16S РНК и 23S РНК у прокариот, предшественники тРНК (пре-тРНК). Они представляют собой копию оперона и содержат информативные и неинформативные последовательности. Образование функционально активных молекул РНК называется процессингом и продолжается после завершения транскрипции.

Процессинг включает в себя: вырезание неинформативных  участков, сшивание информативных участков (сплайсинг) и модификацию 5’ и 3’-концов РНК.

 

 

13.3. Биосинтез белка (трансляция)

Генетическая информация, хранящаяся в ДНК, передается на РНК. Биосинтез белка или полипептида на матрице РНК называется трансляцией.

Процесс биосинтеза белка протекает в 5 основных этапов, каждый из которых требует ряда компонентов.

I этап: активация аминокислот

На этом этапе, который  протекает в цитозоле, а не в рибосоме, каждая из 20 аминокислот ковалентно присоединяется к определенной тРНК, используя для этого энергию АТФ.

Необходимые компоненты:

1) 20 аминокислот; 10 аминокислот являются незаменимыми и должны поступать с пищей; если отсутствует хотя бы одна аминокислота, процесс биосинтеза белка прекращается; 2) ферменты аминоацил-тРНК-синтетазы; 3) тРНК; 4) АТФ; 5) Mg²⁺.

Активация аминокислот  и их присоединение к тРНК осуществляется специфическими аминоацил-тРНК-синтетазами, которые называют активирующими ферментами.

II этап: инициация полипептидной цепи

Необходимые компоненты:

1) мРНК; 2) инициирующая аминоацил-тРНК (формилметионил-тРНК); 3) 30S и 50S субъединицы рибосом; 4) ГТФ; 5) Mg²⁺; 6) факторы инициации (IF-1, IF-2, IF-3).

На стадии инициации требуется разместить рибосому на 5’-конце мРНК и с инициирующим кодоном ее (АУГ) связать антикодоном формилметионин-тРНК.

III этап – элонгация полипептидной цепи

Необходимые компоненты для элонгации:

1) полный набор аминоацил-тРНК; 2) Mg²⁺; 3) факторы элонгации EF-T_u, EF-T_s и EF-G; 4) пептидилтрансфераза.

Цикл элонгации включает 3 этапа: 1) связывание аминоацил-тРНК; 2) образование пептидной связи; 3) траслокация.

1. Фактор элонгации EF-T_u образует комплекс с ГТФ, который связывается со всеми аминоацил-тРНК в цитоплазме. Тройной комплекс, содержащий аминоацил-тРНК, связывается антикодоном с кодоном мРНК в А-участке рибосомы по принципу комплементарности. Фактор элонгации EF-T_u обладает ГТФ-азной активностью и гидролизует ГТФ. После этого EF-T_u, ГДФ и Рн удаляются из рибосомы и исходный комплекс регенерирует при помощи T_s и ГТФ. 

2. С участием фермента пептидилтрансферазы (составная часть 50S субъединицы рибосомы) происходит образование пептидной связи между находящимися рядом формилметионином и аминокислотой в А-участке за счет энергии макроэргической связи аминоацил-тРНК.

3. После образования связи ненагруженная тРНК занимает Р-участок, а дипептидил-тРНК знимает А-участок. 

4. При участии фактора EF-G и за счет энергии ГТФ происходит процесс транслокации – рибосома перемещается на один кодон мРНК в направлении 5’→3’ и пептидил-тРНК перемещается в Р-участок.

5. В результате транслокации в А-участок рибосомы приходит следующий новый кодон мРНК. К нему методом случайного подбора присоединяется комплементарная аминоацил-тРНК. Между дипептидом Р-участка и аминокислотным остатком в А-участке замыкается пептидная связь. Возникший трипептид транслоцируется в Р-участок, а в А-участок приходит следующий новый кодон мРНК и т.д. Таким образом, процесс повторяется пока в Р–участок не придет один из терминирующих кодонов.

IV этап – терминация

Необходимые компоненты этапа:

1) АТФ; 2) терминирующий (нонсенс-кодон); 3) факторы терминации – RF-1  и RF-2; 4) пептидилтрансфераза; 5) фактор RRF (ribosome release factor).

1. После многих циклов элонгации, в результате которых синтезируется полипептидная цепь белка, в А-участке появляется терминирующий или нонсенс-кодон.

2. В норме отсутствуют молекулы тРНК, способные узнавать нонсенс-кодоны. Факторы терминации узнают данные кодоны: RF-1 узнает кодоны УАА и УАГ, RF-2 – УАА и УГА.

3. Связывание релизинг-фактора с терминирующим кодонам в А-участке активирует пептидилэстеразу, которая гидролизует связь между полипептидом и тРНК в Р-участке. После гидролиза и высвобождения синтезированного полипептида и тРНК рибосома диссоциирует на малую и большую субъединицы, готовых к синтезу новой полипептидной цепи.

 

13.4. Регуляция биосинтеза белка

Живые клетки имеют точно запрограмированные механизмы, регулирующие синтез различных  белков таким образом, что в любой клетке присутствует определенное количество молекул каждого белка, позволяющее ей осуществлять свои метаболические процессы плавно и с максимальной эффективностью.

Процесс биосинтеза белка может регулироваться на уровне транскрипции и трансляции. У прокариот эта регуляции осуществляется преимущественно на уровне транскрипции.

Согласно  теории Ф.Жакоба и Ж.Моно в биосинтезе белков у бактерий участвуют структурные  гены, ген-оператор и ген-регулятор. Структурные гены определяют первичную  структуру белков. Функционирование структурных генов контролируется геном-оператором. Процесс транскрипции начинается с промотора. Деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка ДНК, получившего название  гена-регулятора. Структурные гены и ген-регулятор связаны специфическим белком – репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Если репрессор связан с геном-оператором, то РНК-полимераза не может синтезировать мРНК и, следовательно, белки. Если ген-оператор свободен, процесс транскрипции возможен и информация структурных генов используется для синтеза белков. Освобождение репрессора от гена-оператора происходит при его связывании с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. В качестве индукторов часто выступают субстраты реакций.

В некоторых случаях молекулы репрессора не обладают способностью подавлять деятельность гена-оператора, но приобретают такую способность после образования комплекса с конечным или одним из конечных продуктов биосинтетического процесса. Конечный продукт выступает в качестве корепрессора.

Препараты, влиящие  на синтез белка, широко используются в практике. Индукторы применяются с целью стимуляции синтеза белка в поврежденных или ослабленных длительным бездействием (атрофичных) органах. Ингибиторы синтеза белка применяются в противоположных целях: для подавления деления и роста клеток.

Препараты, усиливающие  биосинтез белков, относятся к  так называемым   анаболическим средствам. Анаболические средства бывают гормональные и негормональные. Наиболее выраженной способностью к индукции синтеза белка из гормонов обладают анаболические стероиды (производные мужских половых гормонов), которые сипользуются для только для стимуляции биосинтеза белков и нуклеиновых кислот в организме. Анаболической активностью обладает инсулин, который активирует синтез белка на уровне трансляции.

К негормональным анаболическим средствам относятся предшественники нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Например, оротат калия (стимуляция синтеза пиримидиновых нуклеотидов), инозин. Данные препараты используются в качестве структурного материала и служит индуктором синтеза белка.

Ингибиторы синтеза белка делятся  на ингибиторы: 1) транскрипции; 2) процессинга  и транспорта РНК и 3) трансляции.

Ингибиторы транскрипции по механизму делятся на три группы: 1) ингибиторы РНК-полимераз; 2) вещества, связывающиеся с матрицей ДНК и нарушающие работу РНК-полимеразы и 3) структурные аналоги нуклеотидов, включающиеся в мРНК. Препаратом 1-й группы является α-аманитин (яд бледной поганки), избирательно ингибирующий РНК-полимеразу III (ответственную за транскрипцию мРНК); рифампицин, ингибирующий ядрышковую РНК-полимеразу I (отвечает за транскрипцию рРНК) и обратную транскриптазу.

Ко второй группе относятся  актиномицин D (используется в биохимических исследованиях), антибиотики оливомицин, дактиномицин и растительные алкалоиды винбластин и винкристин, которые применяются в медицине как противоопухолевые препарты.

К третьей группе относится, например, 5-фторурацил, включающийся в  мРНК вместо природного нуклеотида и  приводящий в негодность синтезируемую  матрицу РНК.

Ингибиторы процессинга и транспорта РНК. К ним относятся ингибиторы внутриядерных РНКаз, РНК-лигаз, осуществляющих различные фазы созревания РНК. Препятствует присоединению полиаденилового фрагмента к мРНК кордицепин.

Ингибиторы трансляции. К ним относятся антибиотики, применяемые как антибактериальные препараты.

Хлорамфеникол действует  на 70S рибосомы и рибосомы митохондрий и хлоропластов эукариот. Хлормафеникол связывается с 50S субчастицей рибосом и блокирует пептидилтрансферазную реакцию, вызывая преждевременный обрыв синтезируемой полипептидной цепи.