Конверсия биомассы в жидкое топливо

   Выход спирта при сбраживании глюкозы  дрожжами родов Saccharomyces и Schizosaccharomyces может быть повышен путем введения в биореакторы ингибиторов метаболизма дрожжей динитрофенола, азида и арсената. В концентрации 0,1 мМ ингибиторы существенно уменьшают выход биомассы. Повышение эффективности образования этанола под действием ингибиторов сопровождается уменьшением накопления побочных продуктов брожения в 2,5 раза. При введении ингибиторов в биореакторы с дрожжами, иммобилизованными в каррагинане, эффективность образования этанола увеличивается на 4,4-8,3%.

    Бактерии  Zymomonas mobilis были выделены в начале XX века из пальмового вина и мексиканского напитка. Они представляют собой палочки шириной 1 и длиной 2 мкм, значительно меньшие дрожжевых клеток, имеющих диаметр 4-6 мкм. Эти бактерии способны расти на питательных средах с высокой концентрацией глюкозы и параллельно образовывать этанол (рис. 96).

   Бактерии  Z. mobilis обладают следующими преимуществами по сравнению с дрожжами: скорость роста Z. mobilis почти в 2 раза больше, чем дрожжей; скорость образования  этанола  по  сравнению  с  традиционным дрожжевым сбраживанием в 6—7 раз больше, что предположительно объясняется лучшим  транспортом питательных веществ к маленьким бактериальным клеткам, чем к большим дрожжевым; выход этанола на 5% выше, чем у дрожжей, т.к. эти бактерии тратят меньше сахара для строительства клеточного материала. 
 

ВСТАВИТЬ 
 

      Преобразование  промежуточного продукта пирувата происходит в две стадии. На первой пируват через пируватдекарбоксилазу декарбоксилируется в ацетальдегид, который через алкогольдегидроназу восстанавливается в этанол. Дрожки получают 2 моля АТФ на 1 моль сброженной глюкозы. Образовавшийся АТФ дрожжи используют для синтеза клеточного материала, роста и размножения. Исследование физиологии обмена веществ у бактерий Z. mobilis показало, что они разлагают сахар другим путем обмена веществ, а именно через 2-кетс-З-дезокси-6-фосфоглюконатный    путь. Пируват также является здесь промежуточным продуктом, который, как и у дрожжей, декарбоксилируется в ацетальдегид, а затем восстанавливается в этанол, при этом из 1 моля глюкозы образуется 2 моля спирта. По сравнению с дрожжами получение АТФ, связанное с превращением глюкозы, у этих бактерий вполовину меньше.  Это приводит к тому,  что  бактерии  Z. mobilis на основе меньше полученной энергии могут построить в половину меньше клеточной массы на 1 моль превращенной глюкозы по сравнению с дрожжами, что ведет, с другой стороны, к более высокому выходу этанола .

      Бактерии  Z. mobilis не нуждаются в кислороде для роста, что значительно облегчает ведение процесса образования этанола.  По сравнению с рядом строго анаэробных бактерий Z. mobilis относительно нечувствителен к кислороду и владеет электронно-транспортнойсистемой, похожей на дыхательную цепь аэробных микроорганизмов. При насыщении кислородом около 10 % Z. mobilis наряду с этанолом образует также относительно много ацетальдегида, который обладает способностью задерживать рост этих бактерий. В то время, когда большинство бактерий при концентрации этанола 10-20 г/л затормаживают свой рост, Z. mobilis, как и дрожжи, обладают необычно большой терпимостью к этанолу, что при определенных концентрациях сахара в растворе позволяет достичь концентрации этанола 13 об. %. Однако установлено, что, после того как концентрация этанола в среде достигает 100 г/л, начинается ингибирование процесса поглощения глюкозы клетками. Предполагают, что ингибирующее действие этанола на спиртовое брожение обусловлено накоплением этанола в клетках бактерий Z. mobilis.  Диффузия этанола через клеточную стенку протекает с низкой скоростью.

     Бактерии  Z. mobilis содержат пентациклические тритерпеноиды или гопаноиды, которые несколько лет назад впервые были обнаружены в различных фракциях нефти.

     С помощью бактерий Z. mobilis можно осуществлять как периодическое, так и непрерывное получение этанола. При непрерывном культивировании бактерий Z. mobilis со скоростью разбавления 0,07 ч сахарный раствор концентрацией 135 г/л почти полностью в течение 900 ч может быть сброжен в этанол. Стационарная концентрация этанола при этом не должна превышать 64 г/л, в противном случае глюкоза не будет потребляться между 20-м и 70-м часом роста. Для экономически оправданного производства этанола важно использование дешевого сахара, поэтому для получения этанола с помощью бактерий Z. mobilis ферментативно осахаренные отходы крахмала.

      Бактерии  Z. mobilis способны производить этанол и из фруктозы. При непрерывном культивировании Z. mobilis ZМ4 в среде, содержащей 100 г/л фруктозы, минеральные соли и Са-пантотенат, максимальная концентрация биомассы равна 0,7 г/л, этанола - 46 г/л при скорости разбавления <0,07 ч . Выход этанола при этом составляет 0,5 г/г фруктозы, а максимальная продуктивность по этанолу - 3 г/(л·ч).

      При скорости   разбавления   1,77 ч   выход этанола составляет 48 г/г, эффективность биоконверсии фруктозы или глюкозы - 96 %. В оптимальных условиях культивирования флокулирующих клеток максимальная концентрация этанола 48-50 г/л. В биореакторе с внутренним сепаратором продуктивность  по  этанолу может быть повышена до

     В настоящее время улучшением свойств Z. mobilis интенсивно занимаются генетики, так как эти бактерии подвергаются методам генетической обработки   значительно   легче,   чем   эукариотические дрожжи. Благодаря методам генной технологии удалось расширить спектр субстратов для Z. mobilis , поэтому в недалеком будущем такие пентозы, как ксилоза и арабиноза, можно будет сбраживать в этанол.

     Впервые результаты работ в области прямой микробиологической трансформации  растительной  биомассы  в   этанол   и   органические кислоты были опубликованы в 1923 г. Тогда было выяснено, что при сбраживании  целюлозы   термофильными   бактериями   образуется большое количество   продуктов,    представляющих    практический интерес. Бактерии — факультативные анаэробы хорошо развивались при 60-65 С, энергично разлагали целлюлозу и утилизировали углеводы. Продукты брожения включали этиловый спирт, уксусную и молочную кислоты, СО , Н₂, СН₄. При сбраживании отработанного сухого хмеля из 1 т сырья получали 180 л смеси спирта и органических кислот, а при сбраживании солодовой дробины - 320 л. Чистые культуры бактерий не были выделены. Годом позже было сообщено, что при сбраживании целюлоз термофильными бактериями в течение 1 суток при 62-66 С разлагалось от 60 до 80 % исходной целлюлозы. В продуктах брожения содержалось 56,8 % уксусной кислоты и 10,3 % спирта. Затем удалось выделить бактерию — возбудитель брожения в чистой культуре, которую назвали Clostridium thermocellum. Чистота этой культуры вызвала сомнения у исследователей, работавших в более поздний период, так как количество продуктов брожения этой культуры сильно изменилось: содержание спирта - от 5 до 25 %, уксусной кислоты  — от 19,6 до 56,8 % от исходной целлюлозы. Позднее  из культуры были изолированы два симбионта — Bac. cereus var  и Bac. stearothermophilus.

     В нашей стране подобные исследования были начаты в 1930 г. в спиртовой промышленности. Работы проводили с элективными культурами бактерий, выделенными из конского навоза. Культуры поддерживали регулярным пересевом на жилкой питательной среде с фильтровальной бумагой и выращивали в течение 3-8 суток при 50 °С на среде с 4 % целлюлозы. При этом выход спирта составлял 15-20 %, органических кислот - 30-40 %. В опытах по сбраживанию древесины, соломы, торфяного мха, костры кенафа, а также свекловичного жома и картофельной мезги было показано, что удовлетворительные результаты дают только растительные материалы, содержащие преимущественно нелигнифицированную целлюлозу. Легче всего сбраживались среды,  нейтрализованные до  рН   7,4-7,8.   Выход  спирта  составлял 16,9 %, молочной кислоты - 18,4, уксусной кислоты - 23,6 % исходной целлюлозы. При сбраживании элективными культурами целлюлолитических бактерий картофельной мезги, свекловичного жома и кукурузных кочерыжек в лабораторных условиях в течение 7-10 суток было получено 12-14 % спирта и до 35 % летучих кислот.

       Проводили в нашей стране и полупроизводственные опыты по сбраживанию свекловичного жома и кукурузных кочерыжек термофильными целлюлолитическими бактериями. При сбраживании 3 %-ного свекловичного жома за 36 ч выход спирта составил 12 %. При переработке кукурузных кочерыжек образовалось 6,56 % спирта. Наиболее высокие результаты были получены при сбраживании не растительного сырья, а технической целлюлозы, из которой выход спирта за 9-12 суток составил 12,8—22 % исходного, а разложение целлюлозы - 90 %. Добавление пептона в среду повышало выход спирта до 26 %. 

      Интерес к изучению химизма брожения целлюлозосодержащих  материалов и получению воспроизводимых результатов побудил исследователей к работе с чистыми культурами целлюлолитических бактерий. Было установлено, что чистые культуры термофильных целлюлолитических бактерий гидролизуют целлюлозу с образованием глюкозы. При содержании в среде 2 % целлюлозы такие культуры бактерий могут образовывать редуцирующие сахара в количестве от 40 до 76,6 % исходной целлюлозы. Отсутствие сахаров в среде объясняется тем, что в культуре помимо термофильных целлюлолитических бактерий присутствует один или несколько видов сопутствующих микроорганизмов, которые быстро ассимилируют образующиеся глюкозу и целлобиозу, превращая их в различные продукты  брожения.

      В работе с чистыми культурами целлюлолитических  бактерий постоянными продуктами обмена были спирт, молочная, уксусная кислоты, в меньших количествах — СО ,Н , муравьиная, янтарная, яблочная, фумаровая кислоты, глицерин и следы ацетальдегида.

     Чистые  культуры целлюлолитических бактерий не образуют индола, сероводорода и метана. Количество спирта, продуцируемое чистыми культурами, меньше продуцируемого смешанным. Благоприятные условия для образования спирта термофильными целлюлолитическими бактериями могут быть созданы оптимизацией состава среды и изменениями, вызываемыми в среде сопутствующими бактериями.

    Из накопительных анаэробных культур термофильных целлюлолитических   бактерий   были   выделены   аэробные   бактерии-спутники, которые оказывали благоприятное действие на их развитие: снижали рН среды,    продуцировали   сложные   азотсодержащие   соединения, витамины группы В и потребляли продукты разложения целлюлозы. Чистая Cl. thermocellulaseum культура ферментирует не более 1-1,5 % целлюлозы. В ассоциации процесс брожения ускоряется, количество сбраживаемой целлюлозы удваивается, образуются этанол, уксусная, молочная, муравьиная кислоты.

      Термофильные  анаэробные бактерии как в чистой, так и в смешанных культурах активно разрушают целлюлозосодержащие субстраты, следовательно, они продуцируют целлюлолитические ферменты. Образование целлюлолитических ферментов термофильными бактериями изучено в зависимости от содержания в среде целлюлозы, времени сбраживания субстрата и температуры. Целлюлолитическая активность резко возрастает в течение первых 3 суток на среде с 1 % целлюлозы         при 60 С.

     Новые методы культивирования анаэробов и определения активности ряда ферментов способствовали некоторым успехам в выделении чистых культур термофильных анаэробных бактерий, разлагающих целлюлозу, и изучению их физиологии и биохимии. Сведения об утилизации углеводов чистыми культурами термофильных анаэробных целлюлолитических бактерий противоречивы, выявлена   способность   термофильного   анаэроба   Cl. thermocellum потреблять целлюлозу, гемицеллюлозу, целлобиозу, ксилозу, но не глюкозу на питательной среде с 0,05 % дрожжевого экстракта. Эта же культура усваивает глюкозу и фруктозу при увеличении содержания дрожжевого экстракта в среде до 0,45 %. Позже было установлено, что она ассимилирует не только глюкозу, фруктозу, но и маннитол. Обнаружены ферменты, участвующие в катаболизме этих веществ.

     Чистая  культура Cl. thermocellum энергично разлагает целлюлозу, скорость ферментации выше при смешанном культивировании. Совместное культивирование может быть использовано для термофилъной биотрансформации целлюлозосодержащих отходов, так как термофильные процессы имеют ряд преимуществ перед мезофильными обладая более высокими скоростями утилизации субстрата и образования. Образование этанола при ферментации целлюлозы растает на 100 % при совместном культивировании с Cl. thermohydrosulfuricum. Физиологическое объяснение этого явления связывают с межвидовым метаболическим взаимодействием бактерий,  которое меняет регуляторные и термодинамические характеристики метаболизма отдельных видов.  
 

     При исследовании сбраживания различных  источников углерода кукурузных отрубей, целлюлозы и целлобиозы чистой культурой Cl. thermocellum установлено, что с наибольшей скоростью этанол, уксусная кислота и сахара образуются из кукурузных отрубей, причем больше всего накапливается сахаров (3,4 г/л), около        1,0 г/л уксусной кислоты и 0,8 г/л этанола. В процессе утилизации целлюлозы в среде обнаруживаются в основном глюкоза и целлобиоза со следами ксилозы. Штамм S-4, полученный путем многократных пересевов на среду с этанолом, устойчив к 50 %-ному содержанию последнего и образует на среде с целлобиозой до 9 г/л этанола. Дальнейшее увеличение синтеза этанола может быть достигнуто путем улучшения метаболизма Cl. thermocellum или добавления второй культуры, которая использовала бы такие сахара, как глюкоза и ксилоза, не утилизируемые Cl. thermocellum.