Качественные реакции на аминокислоты белки

Опыт 2.  Реакции на компоненты дезоксирибонуклеопротеида в гидролизате

Ход работы: 1. Биуретовая реакция на полипептиды. К 1 мл гидролизата добавляют 1 мл 10 %-ного раствора NaOH и 0,5 мл 1 %-ного раствора CuSO4. Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

2. Молибденовая  проба на фосфорную кислоту.  К 1 мл гидролизата прибавляют 2 мл молибденового реактива (раствор (NH4)2MoO4 в HNO3) и кипятят 10 минут на водяной бане. В присутствии H3PO4 жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаждении выпадает желтый кристаллический осадок комплексного соединения фосфорномолибденового аммония:

12(NH4)2MoO4  +  H3PO4  +  21HNO3  ® (NH4)3PO4·12MoO3  +  21NH4NO3  + 12H2O 

Практическая  работа  7

ЛИПИДЫ

  Опыт 1.  Исследование состава общих липидов методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol»)

Ход работы: Для  фракционирования липидов используют стандартные пластинки «Silufol», на которые нанесен тонкий слой SiO2 в качестве адсорбента, для закрепления слоя добавлен крахмал. На пластинки размером 2-13 см наносят с помощью микропипетки раствор липидов в хлороформе (0,3-0,5 мг). Пробу наносят, отступая примерно 1,5 см от края пластинки, при этом желательно получить пятно возможно меньшего диаметра, не нарушая слоя сорбента. Пластинку помещают в широкую, короткую пробирку, выполняющую функции хроматографической камеры, на дно которой предварительно наливается 2-3 мл смеси растворителей: гексан-диэтиловый эфир-уксусая кислота в соотношении 70:30:2.

Пробирку устанавливают  в штатив, закрывают крышечкой  из фольги. Через 10-15 минут, когда растворитель поднимется почти до верхнего края пластинки (не менее чем на 9-10 см), пластинку извлекают из «камеры» и сушат на воздухе в вытяжном шкафу до исчезновения запаха растворителей. Для проявления отдельных липидных фракций, пластинки помещают в «камеру», насыщенную парами йода, на 3-5 минут  до появления окрашенных пятен.

Йод,  растворяясь  в липидах, окрашивается в них  в коричнево-желтый цвет (интенсивность  окраски зависит от длительности проявления). 

Опыт 2.  Выделение холестерина 

Ход работы: 1 г  холестеринсодержащего вещества растирают  с 2-3 г гипса до гомогенной массы, которую скальпелем или стеклянной палочкой распределяют тонким слоем  на предметном стекле и высушивают при 60 0С над пламенем горелки  на расстоянии 20 см и контролируют нагрев стекла, проводя им по тыльной стороне  руки. Высушенный с гипсом мозг соскабливают скальпелем и заливают 5 мл хлороформа. Экстрагируют 5 мин при комнатной  температуре, постоянно интенсивно встряхивая. Затем, экстракт фильтруют  в сухую пробирку и проделывают  качественную реакцию на холестерин. Для этого к 1 мл хлорофорного экстракта добавляют 10 капель уксусного ангидрида и 2  капли конц. H2SO4,  хорошо перемешивают и наблюдают появление зеленой окраски.

Практическая  работа 8

УГЛЕВОДЫ, ИХ ОБМЕН

Опыт 1. Определение глюкозы  феррицианидным  методом

Метод Хаггертона-Иенсена позволяет определять сахар в небольшом количестве крови (0,1 мл). В основу метода положена реакция восстановления красной кровяной слои (гексацианоферрат(II) калия K3[Fe(CN)6]) в щелочной среде в присутствии C6H12O6 и некоторых редуцирующих веществ (мочевой кислоты, глутатиона, креатина, креатинина и др.) в желтую кровяную соль (гексацианоферрат(III) калия K4[Fe(CN)6]). Остаток не восстановленного K3[Fe(CN)6] определяют йодометрическим титрованием в кислой среде:

K3[Fe(CN)6] + C6H12O6  ® K4[Fe(CN)6] + окисленная C6H12O6   + K3[Fe(CN)6] (остаток)

2K3[Fe(CN)6] (остаток) + 2KJ ® 2K4[Fe(CN)6] + J2

J2  + 2Na2S2O3  ®  2NaJ + Na2S4O6

Реакция восстановления гексацианоферрата(II) калия обратима, и доходит до конца только в присутствии Zn2+. Осадок выпадает в виде двойной соли K2Zn3[Fe(CN)6]2 и выводится из реакции:

2K3[Fe(CN)6] + 3ZnSO4 ® K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3K2SO4 

ЦВЕТНЫЕ И ИМЕННЫЕ КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

РЕАКЦИЯ ПИОТРОВСКОГО (БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ)

В белках аминокислоты связаны друг с другом по типу полипептидов и дикетопиперазинов. Образование полипептидов из аминокислот происходит путем отщепления молекулы воды от аминогруппы одной молекулы аминокислоты и карбоксильной группы другой молекулы:

 Образующаяся  группа –С(О)–NН– называется пептидной группой, связь С–N, соединяющая остатки млекул аминокислот, – пептидной связью.

При взаимодействии дипептида с новой молекулой  аминокислоты получается трипептид и т. д.

Дикетопиперазины образуются при взаимодействии двух молекул аминокислот с отщеплением двух молекул воды:

Дикетопиперазины были выделены из белков Н.Д.Зелинским и В.С.Садиковым в 1923 г.

Наличие в белке  повторяющихся пептидных групп  подтверждается тем, что белки дают фиолетовое окрашивание при действии небольшого количества раствора медного  купороса в присутствии щелочи (биуретовая реакция).

Описание опыта. 2–3 мл раствора белка нагревают  с 2–3 мл 20%-го раствора едкого кали или натра и несколькими каплями раствора медного купороса. Появляется фиолетовое окрашивание вследствие образования комплексных соединений меди с белками. 

РЕАКЦИЯ РУЭМАННА (НИНГИДРИНОВАЯ  РЕАКЦИЯ (1911))

a-Аминокислоты  реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты.

Реакция идет по схеме:

Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции.

Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл 1%-го раствора глицина и 0,5 мл 1%-го раствора нингидрина. Содержимое пробирки осторожно нагревают до появления сине-фиолетового окрашивания.  

Реакция Сакагучи

Эта реакция  на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:

Поскольку производные  хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a-нафтола:

Описание опыта. В пробирку наливают 2 мл 0,01%-го раствора аргинина, затем добавляют 2 мл 10%-го раствора едкого натра и несколько капель 0,2% спиртового раствора a-нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромита и вновь перемешивают. Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания. 

РЕАКЦИЯ ФОЛЯ

Это реакция  на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.

Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора цистина, прибавляют 0,5 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают до кипения, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II): 

РЕАКЦИЯ С ФОРМАЛЬДЕГИДОМ

При взаимодействии a-аминокислот с формальдегидом образуются относительно устойчивые карбиноламины – N-метилольные производные, содержащие свободную карбоксильную группу, которую затем титруют щелочью:

Эта реакция  лежит в основе количественного  определения a-аминокислот методом  формального титрования (метод Сёренсена).

Описание опыта. В пробирку наливают 5 капель 1%-го раствора глицина и прибавляют 1 каплю индикатора метилового красного. Раствор окрашивается в желтый цвет (нейтральная среда). К полученной смеси добавляют равный объем 40%-го раствора формальдегида (формалин). Появляется красное окрашивание (кислая среда): 

  РЕАКЦИЯ Циммермана

Это реакция  на аминокислоту глицин.

Описание опыта. К 2 мл 0,1%-го раствора глицина, доведенного добавлением 10%-го раствора щелочи до рН = 8, приливают 0,5 мл водного раствора о-фталевого диальдегида. Реакционная смесь начинает медленно окрашиваться в ярко-зеленый цвет. Через несколько минут выпадает зеленый осадок. 
 

ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ С МЕТАЛЛАМИ 

a-Аминокислоты  образуют с катионами тяжелых  металлов внутрикомплексные соли. Со свежеприготовленным гидроксидом меди(II) все a-аминокислоты в мягких условиях дают хорошо кристаллизующиеся внутрикомплексные (хелатные) соли меди(II) синего цвета:

В таких солях  ион меди координационными связями  соединен с аминогруппами.

Описание опыта. В пробирку наливают 3 мл 3%-го раствора сульфата меди(II), добавляют несколько капель 10%-го раствора гидроксида натрия до образования голубого осадка. К полученному осадку гидроксида меди(II) приливают 0,5 мл концентрированного раствора глицина. При этом образуется темно-синий раствор глицината меди: 

КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ 

Эта реакция  используется для обнаружения a-аминокислот, содержащих ароматические радикалы. Тирозин, триптофан, фенилаланин при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные, имеющие желтую окраску. В щелочной среде нитропроизводные этих a-аминокислот дают соли, окрашенные в оранжевый цвет.

Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора тирозина и добавляют 0,5 мл концентрированной  азотной кислоты. Смесь нагревают  до появления желтой окраски. После  охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия до появления оранжевой окраски раствора: 

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА СОЛЯМИ ТЯЖеЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Описание опыта. В две пробирки наливают по 1–2 мл раствора белка и медленно, при  встряхивании, добавляют по каплям в одну пробирку насыщенный раствор  сульфата меди, а в другую – 20%-й  раствор ацетата свинца. Образуются осадки труднорастворимых солеобразных соединений белка. Опыт иллюстрирует применение белка как противоядия при отравлении солями тяжелых металлов.

Открытие аминного азота в белках

Описание опыта. В сухую пробирку помещают немного  сухого белка, например   желатины . Прибавляют пятикратное количество натронной извести (смесь едкого натра и гидроксида кальция), перемешивают встряхиванием и подогревают. Выделяется аммиак, вызывающий посинение розовой лакмусовой бумажки, смоченной водой. Одновременно ощущается запах жженого волоса, что всегда наблюдается при сжигании белковых веществ.

Открытие серы в белках

Описание опыта. В пробирку наливают около ~0,5 мл раствора уксуснокислого свинца и прибавляют раствор едкого кали до растворения  образовавшегося осадка гидроксида свинца. В другую пробирку наливают ~2–3 мл раствора белка и приливают  такой же объем полученного раствора плюмбита. Нагревают смесь до кипения в течение 2–3 мин. Появление темного окрашивания указывает на образование сульфида свинца. 

РЕАКЦИЯ НА ПРИСУТСТВИЕ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ a-АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКЕ

 Качественной  реакцией на серосодержащие a-аминокислоты является реакция Фоля. Белки, содержащие остатки цистеина или цистина, также дают эту реакцию.

Описание опыта. В пробирку наливают 10 капель раствора яичного белка и вдвое больший  объем 20%-го раствора гидроксида натрия. Содержимое пробирки нагревают до кипения (1–2 мин). К полученному щелочному раствору добавляют 5 капель раствора ацетата свинца(II) и вновь кипятят реакционную смесь. Наблюдается появление серо-черного осадка.

РЕАКЦИЯ НА ТРИПТОФАН 

Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению:

По аналогичной  схеме протекает и реакция  триптофана с формальдегидом.

В ходе проведенного исследования мы выявили по литературным источникам имеющуюся информацию о  цветных  качественных  реакциях на белковые аминокислоты; выполнили  ряд перечисленных реакций и  составили базу данных. Эта база может быть использована в школьной практике как в теоретическом плане, так и в практическом, т. к. мы приводим краткие, но подробные описания выполнения всех опытов.