Хроматографический метод анализа

Количественный анализ:

Площадь под пиком пропорциональна количество аналита присутствуемого в хроматограмме. Вычислив площадь пика используя интегралы, концентрации аналита в исходном образце может быть определена. Концентрация может быть рассчитана по калибровочной кривой, созданной в поиске ответа на серию концентрации аналита, либо путем определения относительного фактора реакции аналита. Относительный коэффициент ответ ожидаемое отношение аналита к внутреннему стандарту (или внешнего стандарта) и рассчитывается путем поиска ответа на известное количество аналита и постоянное количество внутреннего стандарта (химические добавлены в образце при постоянной концентрации, с различными времени удерживания для аналита).

 

2.2 Жидкостная хроматография.

 

В отличие от газовой  хроматографии (ГХ), пригодной для  разделения только таких веществ, которые  можно перевести в парообразное состояние без разложения, жидкостная хроматография, где подвижной фазой служит жидкость, позволяет разделять многочисленные неорганические соединения в виде ионов или нелетучих полярных и неполярных производных. С целью наилучшего разделения соединений различных типов разработано несколько видов жидкостной хроматографии. Адсорбционная хроматография применяется для разделения хелатов металлов. Распределительная хроматография применяется в первую очередь для разделения ионов; для разделения хелатных комплексов металлов она менее пригодна. Обращенно-фазовая хроматография применяется в первую очередь для разделения ионов и ионных пар и в последнее время для разделения хелатов металлов. Ионообменная хроматография применяется для разделения простых ионов и ионных комплексов элементов и неорганических солей. Гель-хроматография применяется для разделения органических комплексов элементов и неорганических солей. Первое успешное хроматографическое разделение неорганических соединений было осуществлено методом распределительной хроматографии ионов на бумаге. В последние годы этот хроматографический метод в значительной степени вытеснила тонкослойная хроматография

(TCX), где для получения тонких  слоев может использоваться целлюлоза.

Очень подробный обзор этих методов.  Системы, применяемые в хроматографии  на бумаге, можно разделить на три основные группы:

1. Неподвижная фаза: целлюлоза (+ вода). Подвижная фаза: смеси органических растворителей (особенно спиртов и кетонов, частично смешивающихся с водой, например бутанолов и т. д.) и водных растворов минеральных кислот, органических кислот, оснований, органических солей. Более 80 таких систем, предназначенных для разделения в общей сложности 45 катионов.
2. Неподвижная фаза: целлюлоза, пропитанная органическими комплексообразующими реагентами (такими, как 8-оксихинолин, 4-оксибензотиазол, дитизон и т. д.). Подвижная фаза: смеси органических растворителей или водные системы.
3. Неподвижная фаза: целлюлоза, пропитанная неорганическими или органическими ионообменниками, такими, как высокомолекулярные амины (например, четвертичные аммониевые основания), или, например, фосфатом циркония.

Подвижная фаза: минеральные  кислоты (или их водные растворы). Перечисленные  выше методы в основном относятся к ионообменным; носителем при этом служит главным образом целлюлоза. Большинство работ, посвященных хроматографии на бумаге в неорганическом анализе, были опубликованы в период между 1950 г. и серединой 60-х гг.; дальнейшим развитием этого метода явилась тонкослойная хроматография на целлюлозных материалах. В настоящей главе приводятся некоторые примеры применения хроматографии на бумаге в количественном анализе. Вплоть до 60-х годов разделение методом жидкостной хроматографии проводилось почти исключительно на бумаге и тонких слоях (исключение составляла лишь ионообменная хроматография). Объясняется это, по-ви- димому, тем, что для обнаружения зон, особенно ийнов, пригодны самые различные реагенты, разделение можно проводить на разнообразных сорбентах, представляющие интерес вещества можно извлекать из слоя сорбента и

определять их содержание количественно. Лишь в последние  годы методика колоночной хроматографии  была настолько усовершенствована, что стала

играть заметную роль в неорганическом анализе. Современная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) позволила повысить эффективность разделения, сократить продолжительность анализа и, что самое главное, осуществить непрерывное детектирование выходящей

из колонки жидкости при помощи разнообразныхвысокоселективных и чувствительных детекторов

При увеличении молекулярной массы веществ, анализируемых газовой  хроматографией, возрастает вероятность  термической деструкции.

Этого легко избежать, если в качестве подвижной фазы использовать жидкость. Сегодня с помощью жидкостной хроматографии производится анализ более 97% от суммы всех веществ, осуществляемых хроматографией. Бурное развитие метода жидкостной хроматографии связано с развитием ее высокоэффективного варианта и с разработкой для него аппаратуры и сорбентов. Отличительной особенностью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является использование сорбентов с диаметром частиц 3-10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности.

Колонки длиной 250 мм, заполненные частицами размером 3, 5, 10 и 20 мкм, будут иметь эффективность, соответственно 40 000, 25 000, 12500 и 6250 т.т. Казалась бы очевидно, что преимущества имеет колонка с диаметром частиц 3 мкм. Однако, чтобы прокачать через такую колонку подвижную фазу с заданной линейной скоростью u придется создать очень высокое давление P

(1)

где d – диаметр частицы; j - фактор сопротивления колонки; h - вязкость;  L – длина колонки.

Так, для колонки 250х4 мм, заполненной сорбентом с диаметром  частиц 10 мкм, и подвижной фазе метанол-вода (70:30) при расходе 1 мл/мин давление на входе в колонку составит 5 МПа. При тех же условиях, но с сорбентом с диаметром частиц 5 мкм, давление будет составлять 20 МПа., а для частиц с диметром 3 мкм - 55 МПа.

Схема современного жидкостного  хроматографа включает насос высокого давления, кран-дозатор, хроматографическую колонку, термостат колонок, детектор, персональный компьютер. Использование колонок, работающих при таком давлении приводит к усложнению всей хроматографической системы. Во первых, необходимы насосы, способные подавать жидкость без пульсаций с таким давлением. При этом для создания градиента (изменения состава подвижной фазы) необходим отбор элюентов из 2-3 емкостей, смешивание этих растворителей, система удаления растворенных газов. Ввод пробы обычно осуществляют через петлевые дозаторы. Соединительные капилляры от насоса до колонки должны выдерживать давление до 60 МПа и иметь минимальный объем для предотвращения внеколоночного размывания. Объем зерна сорбента 3-5 мкм и диаметра капилляров 0,1 мм требует установки целого ряда фильтров.

Такие фильтры используются при заборе элюента, перед петлевым дозатором, перед колонкой. Конструкция  колонки разработана таким образом, чтобы свести к минимуму все пустоты. Детектирование в жидкостной  хроматографии  обычно осуществляют УФ- спектрофотометрами,  дифференциальные рефрактометрами. В ионной хроматографии используется кондуктометрический детектор. Спектрофотометрические детекторы – одни из наиболее используемых.

УФ - спектрофотометр работает в диапазоне 190-650 нм. Он позволяет определять 10-9 г, диапазон линейности 5 порядков.

На сегодня все большее  распространение получает детектор с диодной матрицей (ДМД). Он позволяет  проводить сканирование каждого  из пиков на хроматограмме, с получением его УФ и УВ спектров в области 190-900 нм, определять оптимальную длину волны. В случае неполного разделения подавлять мешающий пик, проводить идентификацию компонентов по библиотеке спектров.

 

Рисунок 5 Схема современного жидкостного хроматографа.

 

Дифференциальный рефрактометр. С его помощью получают сигнал для всех компонентов, показатель преломления которых отличается от показателя преломления элюента. Его чувствительность ~10-6 г, диапазон линейности составляет 4 порядка. Этот детектор чувствителен к изменению температуры, требует хорошего, термостатирования. Его недостаток – трудность или даже невозможность работать в градиентном режиме.

Принцип действия флуориметрического детектора основан на измерении  поглощенного света в виде флуоресценции.

Флуоресцентные детекторы  чувствительнее спектрофотометрических примерно в 100 раз. Его применяют при определении микропримесей.

Кондуктометрический детектор применяют в ионной хроматографии  для измерения проводимости раствора, пропорциональной числу ионов в  растворе, их подвижности. Сигнал детектора  линейно зависит от концентрации ионов в широком интервале — от 0,01 мкг/мл до 100 мг/мл. Высокочувствительное кондуктометрическое детектирование дает предел обнаружения 10-9 г/мл.

Электрохимические детекторы  используют для детектирования веществ, способных окисляться или восстанавливаться под действием электрического тока. Они обладают высокой чувствительностью и селективностью. Их особенно широко используют при анализе биологических объектов.

 В последнее время  для идентификации и чувствительного  детектирования используют масс-спектрометрические детекторы, сочетание хроматографов с масс-спектрометрами с ионизацией связанной плазмой.

Жидкая фаза отличается от газовой большей плотностью и  вязкостью. Сопротивление массообмену  в жидкой фазе возрастает. Коэффициент  диффузии в жидкости на три-четыре порядка меньше, чем в газе. Соответственно в уравнении Ван-Деемтера (12) константа В (куда входит коэффициент диффузии в подвижной фазе резко падает, константа А при равномерном заполнении колонки определяется диаметром зерна А.

Величина сопротивления  массопередаче, определяемого константой С в уравнении Ван-Деемтера (12), будет зависеть от коэффициента диффузии Ds  и толщины слоя неподвижной  фазы. Поскольку частицы сорбента имеют большую поверхность и  состоят из ряда более и менее глубоких пор, то величина этих пор будет влиять на скорость массопереноса и размывание хроматографического пика. Учитывая это обстоятельство, были предложены поверхностно-пористые сорбенты для жидкостной хроматографии (рис.21). Использование поверхностно-пористых сорбентов позволило значительно повысить эффективность колонок ВЭЖХ в начале семидесятых годов*. Однако, в последние годы эти сорбенты применяются редко. Колонки, заполненные поверхностно-пористыми  сорбентами, уступают объемно- пористым  сорбентам с малым размерам частиц по эффективности.

 

Рисунок 6 Типы сорбентов для ВЭЖХ*.

а – поверхностно-пористый;  б - объемно-пористый; в – объемно-пористый с частицами малого диаметра.

 

Из рис. 6 видно, что уменьшение диаметра частицы, сокращает длину диффузионного пути молекул анализируемого вещества в порах сорбентов обоих типов.

 

2.3 Адсорбционная хроматография

 

Газоадсорбционная хроматография  используется реже, чем газожидкостная из-за нелинейности изотермы адсорбции.

К числу неорганических адсорбентов относят силикагель, оксид алюминия, активный уголь, графитированную сажу и молекулярные сита. В газовой хроматографии преимущественно используют широкопористые силикагели, которые получают из обычного силикагеля высокотемпературной обработкой (до 700—950°С) или гидротермальной обработкой с паром в автоклаве. Найден комплекс приемов, который позволяет получать любую разумную структуру силикагелевых адсорбентов как для газовой, так и для жидкостной хроматографии. Вместе с тем оксид алюминия получают лишь в нескольких модификациях, имеющих близкую к силикагелю удельную поверхность. Удерживание на силикагелях и на оксиде алюминия зависит от удельной поверхности, степени насыщения поверхности водой, условий предварительной термообработки, а также от свойств разделяемых соединений, в первую очередь их полярности, наличия водородных связей и некоторых других свойств. Заслуживает внимания  графитированная сажа, получаемая нагреванием сажи в атмосфере инертного газа при 3000°С. Вследствие этого удаляются все летучие примеси, происходит перекристаллизация углерода в кристаллы полиэдрической формы и поверхность становится почти свободной от ненасыщенных связей, электронных пар, свободных радикалов и ионов. В результате улучшается симметрия пиков. Графитированная термическая сажа является наиболее подходящим адсорбентом для разделения геометрических изомеров. Осуществляется также модификация поверхности графитированной сажи (адсорбенты карбопак В и карбопак С) добавками микроколичеств кислот типа пикриновой, фосфорной или неподвижных фаз.

При использовании графитированной  сажи реализуются наиболее существенные достоинства газоадсорбционной  хроматографии по селективности  и эффективности. Кроме того, на этот сорбент можно нанести небольшое  количество неподвижной фазы.

  Структура кристалла цеолита 4А может быть описана формулой Na₁₂(Al₂O₃)₁₂×(SiO)₁₂ ×27H₂O.

Рисунок 7 Анализ шотландского виски на карбопаке В + 5% карбовакса 20М. 1 – ацетальдегид; 2- метанол; 3 – этанол; 4 – этилацетат; 5 – пропанол;

6 – изобутанол; 7 – уксусная кислота; амиловый и изоамиловый спирты.

Диаметр пор в молекулярных ситах определяется размером атома  катиона. Сама структура — микропористая  и размер пор близок к размерам малых молекул. Поэтому цеолиты  пригодны для разделения газов и  самых легких углеводородов, а также позволяют осуществлять групповое разделение линейных олефинов от изо- и циклических аналогов. Цеолиты легко поглощают влагу и используются для осушки газов.