Биофизика как наука

K-Na-АТФаза – молекула из двух субъединиц, имеющих внутренние полости: -большая субъединица (полипептид), -малая субъединица (гликопротеид).  обладает высоким сродством к Na +,  - к К+. Полость -субъединицы заполняется 3 ионами Na+, полость -субъединицы заполняется 2 ионами К+. Потом у -субъединицы сродство к Na+ падает, а у -субъединицы сродство к К+ возрастает.

За счет флуктуации происходит пространственное совмещение полостей субъединиц и обмен ионами. В конце цикла полости открываются, и ионы их покидают.

Другая гипотеза. В начале происходит заполнение полостей описанным выше способом, затем поворот K-Na-АТФазы на 1800. После чего ионы покидают полости, а K-Na-АТФаза опять поворачивается на 1800. Если молеула постоянно переворачивается, то это должно привести к перестройке молекулярного слоя – спорный момент.

Механизм вторично активного транспорта

заключается в переносе веществ через мембрану против концентрационного градиента, обеспечиваемом энергией, которая высвобождается при переносе другого вещества по градиенту. То, что транспортируется по градиенту, называется синпортом, или ко-транспорт. Пример, транспорт а-к или сахаров через био мембраны.

Транспорт в клетки аланина.

В присутствии внеклеточных ионов Na+ транспорт аланина в клетки осуществляется  до тех пор, пока внутриклеточная концентрация Na+ будет в 7-10 раз больше внеклеточной. Если во внеклеточной среде Na+ отсутствует, то концентрация аланина внутри клетки не отличается от внеклеточной.

2 рисунка. max скорость транспорта в двух случаях одинакова. Внеклеточный Na+ оказывает непосредственное влияние на транспорт аланина (различный наклон графиков). Если повысить внутриклеточную концентрацию Na+, то аланин из клетки будет выходить во внеклеточную среду. Вторично активный транспорт не зависит от концентрации Na+ вне клетки, а зависит от концентрации градиента ионов Na+. Градиент Na+ является движущей силой, промежуточной стадией в процессе использования энергии (в системе вторично активного транспорта).

Системы антипорта, или контр-транспорта – это система вторично активного транспорта, функциорующая на основе переносчика обменника, обеспечивающего выведение из клетки транспортирующего вещества против его концентрационного градиента в обмен на сопряженный, пассивно поступающий в клетки поток ионов Na+. Движущей силой является потенциальная энергия концентрационного градиента ионов Na+.

Примеры:

1.        Транспорт Ca2+ в обмена на Na+, осуществляется во многих типах клеток. Уровень концентрации внутриклеточного Ca2+ 10–9 моля, внеклеточной – 10–6 моля. Мышечное сокращение, выделение нейромедиаторов синапсами регулируется Са2+-зависимыми К+-каналами. Механизм: и ионы Nа+ и ионы Са2+ имеют один и тот же переносчик, у внутренней поверхности мембраны, обладающей высоким сродством к Са2+, у наружной – к Nа+. Са2+-насос удаляет Са2+ из клетки.

2.        Антипортная система клеток проксимальных отделов нефрона, обменивающая Nа+ на Н+. Из мочи к клетки проксимальных отделов нефрона выделяется Nа+, взамен выводится Н+. Система не совершает электрическую работу, поэтому не надо тратить энергию. K-Na-насос сохраняет Nа+ в организме.

Визикулярный транспорт

происходит путем эндо- и экзоцитоза. Это вид транспорта, при котором вещества перекачиваются внутрь клетки или из нее внутри маленьких пузырьков или визикул. Жидкие вещества – пиноцитоз, твердые вещества – фагоцитоз. Когда переносятся гормоны или медиаторы, то вначале они взаимодействуют с мембранными рецепторами. Рецепторы обладают способностью к латеральной диффузии, при этом образование комплекса рецептора с лигандом вызывает перемещение этого комплекса в углубление мембраны.

Образуется окаймленная ямка. Внутренняя поверхность покрыта особым белком – клатрином, он связывает занятую лигандом молекулу рецептора, затем этот белок участвует в отшнуровывании визикулы от поверхности мембраны. Визикулы разрушаются, но некоторые проходят насквозь, и тогда вещества высвобождаются с другой стороны.  Когда визикула разрушается внутри клетки – эндоцитоз, вне клетки – экзоцитоз. Мембранный материал вновь включается в клетку  круговорот.

Потенциал покоя

это разница потенциалов между цитоплазмой и внеклеточной средой, существующая в каждой живой клетке, находящейся в состоянии покоя. Внутриклеточная среда заряжена отрицательно. Величина ПП может быть различной, зависит от состояния клетки от –15 до –90 мВ у большинства клеток.

Для того, чтобы измерить величину ПП используется микроэлектродная техника. Используется специальный вид электродов, отличающийся намного меньшим диаметром кончика (доли мкм, или 1 мкм). Бывают стеклянные и металлические, по форме напоминают копье, необходим раствор электролита для хорошего проведения электрического тока.

Основные теории ПП:

1.        В 1848 г. Дюбуа-Реймон "теория электромоторных молекул" (теория заряженных диполей). Дюбуа-Реймон предположил, что на мембране находятся диполи, ориентированные отрицательным зарядом внутрь. При возбуждении диполи поворачиваются на 1800, что приводит к положительному заряду внутри клетки. Разность потенциалов в этой теории является предшествующей.

2.          В 60-е годы XIX в. – альтернативная теория Германа. В состоянии покоя мембрана клетки не заряжена, и ПП отсутствует. Однако при повреждении, в поврежденном участке появляется избыток отрицательного заряда, в силу наличия кислых продуктов. Поэтому между поврежденными и неповреждеными участками возникает электрический ток. Теория Германа исключала существование разности потенциалов на мембране.

3.        Теория полупроницаемой мембраны Берштейна. 1906 г. Положения:

~         мембрана обладает свойством полупроницаемости (в специальных экспериментах в группе Пфейффера показали: при пропускании электрического тока – поляризация мембраны и появление концентрационной электро-двигательной силы.

~         наличие концентрационных градиентов на биологической мембране. В исходном состоянии К+, Сl–, Na+ и другие распределены различно на мембране. Берштейн обратил внимание на К+-концентрационный градиент по направлению из клетки наружу.

Существуют механические насосы. Перемещение из клетки через мембрану осуществляется по градиенту; но выход не бесконечен, как только К+ выйдет из клетки, образуются силы, противодействующие этому выходу. 1. Первый положительный заряд на мембране препятствует выходу остальных (электростатическое отталкивание). 2. Крупные молекулы, которые не могут проходить через мембрану, мембраны их не пропускают, они не будут пропускать К+ мембранный слой ионов К+ снаружи, слой анионов изнутри. При повреждении мембраны анионы выходят наружу и создается электрический ток.

Еm = RT/F * ln([K+]ant/[K+]in)

Еm – ПП, F- число Фарадея.

Эксперимент: кнаружи поверхности мембраны облицеров. соли К+  выход ионов К+ из клетки затруднен  величина ПП?

Результат: ампликация солей К+ к наружной поверхности мембраны приводит к снижению величины ПП, степень снижения оказалась пропорциональной концентрации К+ в облицеров. растворе.

Вывод: К+ имеет основное значение в генерации ПП.

Если удалить Na+ или изменить его концентрацию во внеклеточной жидкости, это не толко не снизит величину ПП, но даже приведет к небольшой дополнительной поляризации мембраны Na+ не играет существенной роли в генерации ПП.

Прямые определения концентрации К+ в клетке и окружающей среде показали хорошее соотношение с теоретически рассчитанными значениями ПП. После Бернштейна данные подтверждались.

Джерард и Фурузава, 1930 г. Работали на нервах краба в условиях гипоксии и апоксии (полное отсутствие О2). ПП прогрессивно снижался и, наконец, исчез в нормальном целостном участке нерва.

Вывод: энергия, необходимая для генерации ПП берется из окислительных процессов.

Современная мембранная теория

Ходжкин и Хаксли разработали в 30х годах ХХ в., используя микроэлектродную технику на гигантских аксонах кальмара. ПП –50 мВ. При возбуждении генерации ПД амплитуда до 100 мВ.

С позиции теории Берштейна. При возбужедении растет проницаемость мембраны для всех ионов. При этом происходит перераспределение этих ионов в сторону выравнивания концентрации внутри и вне клетки, поэтому ПД = ПП ( –50 мВ)  кризис мембранной теории Берштейна.

Основные положения современной мембранной теории

1.        Клеточные мембраны обладают избирательной проницаемостью не только к ионам состоянии К+, но и к Na+ и к другим.

2.        Эти виды ионной проницаемости обнаруживают самостоятельную изменчивость в зависимости от функционального состояния клетки.

В мембране диэлектриком явлется липидная фаза (конденсатор), чтобы зарядить конденсатор до –75 мВ на 1 мм2 должно находиться 5000 пар ионов. В генерации ПП участвует К+, концентрация внутри клетки в 20 раз выше  концентрационный градиент для внутрь клетки (так как во внеклеточной среде концентрация ионов Na+ в 5-15 раз больше, концентрация Сl– вне клетки в 20-100 раз больше.

Чем больше проницаемость мембраны для иона, тем больше в клетку вносится данного иона.

Р К+ : Р Na+ : Р Сl–  =  1 : 0,04 : 0,045

Уравнение Гольдмана:

Em = RT/F * ln (PК+*[К+]out+ PNa+*[Na+]out+ PCl–*[Cl–]out)/(PК+*[К+]in+ PNa+*[Na+]in+ PCl–*[Cl–]in)

Потенцил Действия

1.        Объясняется поворотом диполя на 1800.

2.        Теория альтерации Германа. При возбуждении возникает избыток кислых продуктов, которые несут отрицательны заряд, что приводит к разности потенциалов между возбужденным и невозбужденым учаском.

3.        Мембранная теория Берштейна. В возбужденном участке мембраны резко увеличивается проницаемость  для всех ионов, концентрации ионов смешиваются и участок становится электронейтральным.

4.        Ходжкин и Хаксли. Рост проницаемости мембраны для ионов в месте воздействия. При возбуждении электропроницаемость мембраны увеличивается примерно в 500 раз. Max увеличивается проницаемость мембраны для Na+ (отсюда Na-теория ПД). Na+ свободно проходит внуть клетки. При возбужедении электро-химическое равновесие определяется потенциалом Na+. Равновесный потенциал для К+ = –97 мВ, для Na+ = +50 мВ. При возбужедении мембрана перезаряжается. Положение обратной активации и инактивации Na+-каналов, Na+-канал может активироваться (открываться) при определенных значениях потенциала. Причина активации Na+-каналов – деполяризация мембраны, чем больше деполяризация, тем больше проницаемость мембраны для Na+. Зависимость близка к линейной в подкор уровне; как только мембрана достигнет критического уровня деполяризации – зависимость нелинейная, лавинообразный вход Na+ в клетку.

1). Для объяснения реполяризации используется положение об инактивации Na+-каналов. При приближении потенциала мембраны к равновесному для Na+, Na+-каналы инактивируются и посупление Na в клетку прекращается. К графику: в основе регенеративный процесс (сам себя поддерживающий), развивающийся по принципу обратной связи.

2). Рост К+ проницаемости мембраны. Не столь значителен, как для Na+ ( в 5-15 и 500 раз соответственно). Проницаемость для К+ развивается медленнее, чем для Na+. Ионы К+ в этой ситуации будут выходить наружу и выносить заряд.

3). Механизм активного транспорта, представленный K-Na-насосом. 3 Na+ внутрь и 2 К+ наружу.

Эксперименты Ходжкина и Хаксли.

Гигантский аксон кальмара. Из внеклеточной среды были удалены 2/3 Na+. При этом амплитуда ПД снизилась  на 50%. Замена внутриклеточного Na+ на другие ионы приводит к некоторому росту ПД. Замена ½ внутриклеточного К+ на Na+ приводит к значительному снижению ПД.

Метод фиксации потенциала

метод Петч-Клемпинга. С его помощью можно зафиксировать на длительное время значение мембранного потенциала на любом желаемом уровне. Это делается с помощью внешнего генератора напряжения

Суммарные мембранные токи при ПД

1.        Подпороговая область:

Слабое изменение мембранного потенциала, суммарный ионный ток направлен от клетки наружу, так как поток К+, выходящий из клетки, уже усиливается из-за удаления мембранного потенциала от равновесного потенциала для К+. Входящий ток Na+ еще слаб, так как рост Na+-проницаемости пока невелик. Однако с развитием деполяризации Na-ый поток постепенно нарастает.

2.        Критический уровень деполяризации:

В этот момент суммарный ионный ток через мембрану равен нулю, так как встречные токи ионов Na+ и К+ уравновешивают друг друга. Даже небольшая дальнейшая деполяризация приводит к росту входа Na+-тока в сотни раз.

3.        Во время фазы деполяризации резко увеличивается Na+-проницаемость и суммарный мембранный ток, направленный внутрь клетки. Выходящий К+-ток растет медленнее и становится заметным только к моменту пика потенциала.

4.        Фаза реполяризации:

В момент пика потенциала большинство Na+-каналов инактивированны, а К+-ток max. Поэтому суммарный мембранный ток – выходящий.

Кальциевая теория активации и инактивации Na+-каналов

В состоянии покоя у наружного отверстия Na+-канала находится Са2+, который электростатически тормозит проникновение Na+ в канал. При возбуждении наружная поверхность мембраны заряжена отрицательно, при этом Са2+ уходят со своих мест, вход открывается и Na+ входит в клетки.

Инактивация: по ходу деполяризации узкие Na+-каналы могут закупориваться Na+. Во многих каналах есть воротные белки (могут менять свое местоположение под влиянием изменения потенциала). В состоянии покоя активационный белок закрыт, а инактивационный открыт. При возбуждении открывается активационный белок в момент закрывания инактивационного белка. В конце реполяризации белки так же закрываются и потом открываются (исходное состояние).