Морфогенез гвоздики (dianthus caryophyllus l.) in vitro

     … 

     1.3 Влияние условий культивирования на морфогенез гвоздики  in vitro  

     Первая  работа по микроразмножению ремонтантной гвоздики была сделана Хакеттом и Андерсоном а 1967 г. Однако воспроизводство гвоздики по их методике, предполагающей предварительное формирование каллуса и последующую индукцию в его массе меристематических очагов, требует довольно больших затрат времени и не всегда удается [17].

     … 

 

       2 Материал и методы исследований 

      2.1 Объект исследования 

      Объектом  исследования являлись стерильные пробирочные растения гвоздики садовой (Dianthus caryophyllus L.), сорт Silkroad (рисунок 2.1).

      Рисуноу 2.1 – Dianthus caryophyllus L. в культуре in vitro 

      Гвоздика (Dianthus) – род многолетних растений семейства Гвоздичные (Caryophyllceae). Род насчитывает более 300 видов. Среди многолетних гвоздик имеются виды, культивируемые как двухлетние растения. Дикорастущая гвоздика распространена в зонах умеренного климата. В декоративном садоводстве в настоящее время используются многочисленные гибриды [30,31].

      Для гвоздик характерно одновременное  наличие вегетативных и цветущих побегов на растении. Вегетативные побеги обычно гораздо короче и не ветвятся. Листья линейные или линейно-ланцетные, иногда даже шиловидные, всегда супротивные. Узлы с характерным утолщением. Нередко у старых растений нижняя часть стеблей одревесневает, и они напоминают полукустарники. Генеративные побеги в разной степени ветвистые, чаще всего ветвление начинается только в соцветии, представляющем собой метелку или головку, нередко малоцветковую, часто встречаются одиночные цветки [30].

      Чашечка трубчатая, сросшаяся, имеющая пять зубцов, при основании чашечки располагаются 1-4 пары прицветных чешуи, количество, форма и размер которых являются признаком, характерным для каждого вида. Лепестков 5 с горизонтальной пластинкой и длинным ноготком, часто у основания пластинки имеются волоски, образующие бородку. В культуре часто встречаются формы с полумахровыми и махровыми цветками. Окраска пластинки лепестка – белая, розовая, красная, различных оттенков, реже – лавандовая и желтая. У ремонтантных гвоздик получены сорта с фиолетовой, оранжевой и зелёной окраской лепестков. Тычинок 10, столбиков 2, часто они выступают из цветка [30].

      Плод  – продолговатая одногнёздная коробочка, вскрывающаяся на верхушке четырьмя зубцами. Семена многочисленные, обычно чёрные, плоские, округлые или продолговатые [30].

      Садовые сорта голландской гвоздики (Dianthus caryophyllus) пользуются большой известностью и ценятся почти так же, как роза. Происхождение – Южная Европа. В культуре есть много разновидностей голландской гвоздики. От нее произошли первые ремонтантные гвоздики. Разнообразие колеров, хороший запах и красивое строение цветка являются особенностями гвоздики. Эти качества редко соединены в одном растении [31]. 

      2.2 Постановка эксперимента 

     Для получения хорошо растущей стерильной культуры растительный материал (побеги) извлекали из пробирок, делили на микрочеренки и помещали в пробирки на агаризованную (0,7%) питательную среду. В качестве основной среды использовали среду Мурасиге и Скуга (МС) (рН=5,8-5,9) [7], включающую витамины: тиамин и пиридоксин по 1 мг/л и сахарозу в концентрации 40 г/л.

     Эксперимент проводили по схеме представленной на рисунки 2.2.

 

      

 
 

 
 
 

   
 
 

 
 
 
 

 
 
 
 

 Рисунок 2.2 – Схема эксперимента

 

      2.3 Методы исследований 

      2.3.1 Методы стерильной  работы  

      Все применяемые методы в работе с  клеточными культурами требуют полнейшей  асептики, которая достигается различными способами.

      Стерилизация  посуды и инструментов. Инструменты, чашки Петри и колбы, предварительно закрытые фольгой заворачивали в бумагу и стерилизовали в сухожаровом шкафу при t = 180 °°С в течение 45 минут. Питательные среды автоклавировали при избыточном давлении 0,8 – 1,0 атм (181°С) в течение 15 минут [7]. 

      2.3.2 Работа в ламинар-боксе 

      Перед работой ламинар-бокс стерилизовали. Прежде всего, поверхность стола и стен протирали 70 % спиртом, затем помещали в ламинар необходимые стерильные инструменты, посуду и сосуд с 70 % спиртом, в котором находится пинцет и другие инструменты, необходимые во время работы. Все доступные поверхности посуды протирали 70 % спиртом.

      Помещали  в ламинар сосуды с растительным материалом. Поверхность сосудов и руки тщательно протирали 70-% спиртом. Включали спиртовку. Колбы и баночки, закрытые крышками из фольги открывали, осторожно разворачивали края фольги, снимали ее и клали на стол. После проведенной работы, брали пинцет из сосуда со спиртом, обжигали его в пламени спиртовка, обжигали горло сосуда, затем брали пинцетом крышку из фольги, обжигали ее с двух сторон и закрывали горло сосуда. Через некоторое время после охлаждения фольги ее прижимали плотно к горлу сосуда, закрывали целлофаном, сосуд подписывали. По окончании работы выключали последовательно: 1 – спиртовку, 2 – вентиляционную систему, 3 – сеть. Убирали использованную посуду и инструменты. Поверхность стола протирали 70 % спиртом [7].

      2.3.3 Приготовление питательной среды 

      В состав питательной среды входят минеральные соли (макро- и микроэлементы, соли железа, углеводы, витамины, регуляторы роста, агар (табл. 2.1). 

Таблица 2.1 –  Состав среды МС

 

      Для приготовления питательной среды  готовили маточные растворы макро- и  микросолей. Особой тщательности и  аккуратности придерживались при приготовлении  маточных растворов микросолей и  регуляторов роста, так как незначительные ошибки могли сказаться на росте ткани.

      Минеральные соли взвешивали в стеклянной таре, микроэлементы, витамины, сахарозу, регуляторы роста – на бумаге калька. Все компоненты среды готовили только на дистиллированной воде. Порядок приготовления питательной среды подробно изложен в статье [32].  

     2.3.4 Микроразмножение  

     Стерильные  растения в условиях ламинар-бокса  извлекали из пробирок. На стерильных матрасиках при помощи пинцета и скальпеля делили на черенки (экспланты). Экспланты помещали в пробирки на агаризованную среду. Штатив с пробирками переносили в условия культивирования. 

      2.3.5 Морфометрические измерения  

      Измерения проводили ежедневно в течение первых 14 дней и 1 раз в неделю в дальнейшем. При этом учитывали следующие показатели: число эксплантов образующих побеги, количество побегов на эксплант, интенсивность их роста. 

      2.3.6 Повторности и статистическая обработка результатов 

      Все опыты проводили не менее 3 раз  по 10-16 растений в каждом варианте опыта. Статистическая обработка полученных данных проведена на ПК с использованием программ Biostat, Статистика v.2.6, Microsoft Excell 2000. В таблицах и на графиках представлены средние значения из всех опытов с их стандартными ошибками, рассчитанные по стандартным биометрическим критериям. Достоверность различий между вариантами оценивали по t-критерию Стьюдента [33]. 
 
 

      3 Результаты и их обсуждение 

      3.1 Влияние регуляторов роста на органогенез эксплантов                         Dianthus caryophyllus L. 

     Одним из важнейших факторов, оказывающим существенное влияние на морфогенез растений в культуре in vitro, является гормональный состав среды [35,36,37,38].

      Нами  изучалась регенерационная активность эксплантов в зависимости от внесения в питательную среду следующих регуляторов роста ауксинов (ИУК, 2,4-Д), цитокининов (6-БАП, кинетин, тидиазурон).

       В первой серии опытов исследовали  совместное действие 6-БАП и ИУК. При изучении влияния регуляторов роста на органогенез гвоздики садовой установлено, что совместное применение 6-БАП и ИУК активизировало регенерационную активность эксплантов. Максимальное количество микропобегов de novo – 3 штуки на эксплант – формировалось в варианте с использованием 4,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК (таблица 3.1) (рисунок 3.1).  

Таблица 3.1 – Влияние 6-БАП и ИУК на побегообразование у гвоздики садовой, шт./эксплант

 

       Немаловажное  значение для последующего размножения  гвоздики                in vitro имеет размер образовавшихся побегов, так как это напрямую связано с количеством возможных новых эксплантов [39-54].

Рисунок 3.1 – Побегообразование у гвоздики садовой на среде 

с 4,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК 

       … 

 

Выводы 

      1 Проведенные исследования показали, что гвоздика садовая (Dianthus caryophyllus L.)  являются удобной биологической моделью для выяснения механизмов гормональной регуляции органогенеза в культуре клеток и тканей в условиях in vitro.

     2 Для формирования максимального числа побегов у гвоздики садовой в условиях in vitro в качестве регуляторов роста в среду необходимо вносить             4,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК.

     3 Для формирования побегов максимального  размера так же 4,0 мг/л 6-БАП  + 0,5 мг/л ИУК.

     4 Для большинства препаратов слишком высокие и низкие концентрации угнетают регенерационные процессы у эксплантов гвоздики садовой. 
 
 
 
 
 

 

Список использованных источников 

      1  Мосин О. В.   Фитобиотехнология   и  ее  прикладные  аспекты  /              О. В. Мосин. – 2005. – М. : Знание. – 18 с.

            2  Миронова О.  Ю. Разработка и совершенствование  технологий клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур: дис. ... канд. биол. наук / О. Ю. Миронова. – М. – 2004. – 146 c.