Влияние 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-дезаминазы на устойчивость растений к стрессовым условиям окружающей среды

               ▼                                                          ▼

          Этилен                                                       Аммиак                                                                                                          

               │                                                     α-кетобутират        

               │

               │          ___ ____                                                       

        Удлинение  корней

                       Растение                                                           Бактерия

Рис.2. Схематическое  изображение механизма, с помощью  которого бактерии, стимулирующие рост растения, снижают количество этилена в растении (Б. Глик, Дж. Пастернак, 2002). 

Нативная форма AЦК-дезаминазы представляет собой тример (104 кДа), ее температурный оптимум близок к 30°С, а оптимум рН около 8.5 (M. Honma, T. Shimomura, 1978; C. B. Jacobson et al., 1994). В составе этого фермента присутствует пиридоксаль-5´-фосфат (M. Honma, T. Shimomura, 1978; J. Li, B. R. Glick, 2001).

Было отмечено, что бактерии, синтезирующие АЦК – дезаминазу, способствуют удлинению корней растений (J. A. Hall et al., 1996). Кроме того, у растений, выращиваемых в присутствии таких бактерий, наблюдалось значительное снижение количества стрессового этилена, вырабатывающегося в растении в ответ на биологические и средовые воздействия и действие патогенов (B. R. Glick, 2003).

Некоторые бактерии – Bradyrhizobium elkanii, Burkholderia andropogonis –  синтезируют  ризобитоксин (W. Ma et al., 2002; F. C. Guinel, R. D. Geil, 2002). Ингибитором синтеза этилена  также является  AВГ (аминоэтоксивинилглицин) – структурный аналог ризобитоксина. Принцип действия обоих  веществ основан на негативном влиянии на АЦК-синтетазу (W. Ma et al.,2002). Показано, что этилен угнетает образование клубеньков при симбиозе растения с ризобактериями, поэтому выработка последними ризобитоксина снижает это ингибирующее влияние (F. C. Guinel, R. D. Geil, 2002).

1.2.3. Способность к синтезу  АЦК-дезаминазы у ризосферных  микроорганизмов  

АЦК-дезаминазная активность была выявлена у дрожжей Hansenula saturnus (R. Minami et al., 1998) и грибов Penicillium citrinum (Y. J. Jia et al., 2000). Способность к синтезу АЦК-дезаминазы часто встречается у представителей родов Pseudomonas, Enterobacter, Kluyvera, а также у симбиотических бактерий Rhizobium leguminosarum (B. R. Glick et al., 1995; G. I. Burd et al., 1998; C. Wang et al., 2000; D. M. Penrose, B. R. Glick, 2003; W. Ma et al., 2003). Для многих ризосферных бактерий, стимулирующих рост растений, способность к синтезу АЦК-дезаминазы является ключевым фактором, обеспечивающим ростостимулирующие свойства. Так, показано, что инактивация гена acdS (кодирующего АЦК-дезаминазу) бактерий Pseudomonas putida GR12-2 и Enterobacter cloacae UW-4 значительно снижает способность этих микроорганизмов стимулировать удлинение корней рапса (B. R. Glick et al., 1994; J. Li et al., 2000).Ген acdS встречается не только у стимулирующих рост растения бактерий.

Сейчас выделено и охарактеризовано как минимум 6 генов АЦК-деаминазы из различных бактерий, относящихся к родам Pseudomonas, Enterobacter, Hansesenula и др. (S. Shah et al., 1998; J. Li, B. R. Glick, 2001).   Пять из них оказались высокогомологичными, в то время как шестой, найденный у Pseudomonas sp. штамма АСР, значительно от них отличается (S. Shah et al., 1998).

Было показано наличие acdS гена у некоторых патогенных бактерий, в частности, патогена гладиолусов Burkholderia gladioli, патогена лука B. cepacia. (D. Blaha et al., 2006). Также ген acdS был выявлен у некоторых штаммов Agrobacterium, причем все они содержали Ti-плазмиду (S. B. Gelvin et al., 2000). Более того, этот ген был обнаружен у некоторых патогенов человека, в частности, у штаммов B. сepacia, обнаруженных у больных цистофиброзом (J. R. W. Govan et al., 1993), и B. mallei (W. C. Nierman et al., 2004).

Одним из главных механизмов, используемых бактериями для улучшения  роста растения, считается понижение уровня этилена в растении благодаря активности бактериального фермента АЦК-дезаминазы. Данные представлены  в виде модели, согласно которой AcdR и AcdB совместно регулируют экспрессию гена acdS. (Cheng Z, Duncker BP, McConkey BJ, Glick BR., 2008)

1.3. Влияние бактериального  гена acdS  на устойчивость растений  к стрессовым факторам среды 

Этилен является важным растительным гормоном, влияющим на такие процессы, как прорастание, развитие цветков, реакцию на многие факторы окружающей среды. Особенно хорошо изучено влияние этилена на созревание плодов. Использование химических препаратов, блокирующих биосинтез или действие этилена, задерживает созревание плодов и старение многих видов растений. Однако более перспективной считается возможность снижение уровня этилена в растении без экзогенного вмешательства и использования химических веществ, т.е. путем создания трансгенных растений. Например, H. J. Klee et al., 1991, получили трансгенные растения томатов, несущие ген acdS, выделенный из одного из штаммов почвенных бактерий Pseudomonas sp., способных разрушать АЦК. Ген был помещен под контроль 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты. Данная конструкция использовалась для трансформации клеток томатов. У некоторых растений, полученных в ходе эксперимента, наблюдался высокий уровень экспрессии АЦК-дезаминазы, а количество этилена снижалось на 90%. Плоды этих растений имели более длительный срок хранения по сравнению с нормальными.

 Поскольку АЦК участвует только в биосинтезе этилена, введение гена acdS в растение приведет только к ингибированию биосинтеза этилена. Более того, в результате деградации АЦК образуется α-кетобутират, который является естественным метаболитом растений и, следовательно, не оказывает на растение негативного влияния.

V. P. Grichko et al., 2000, получили  трансгенные растения томатов,  экспрессирующие ген acdS под контролем  одного из следующих промоторов: 35S-промотора вируса мозаики цветной  капусты (обеспечивает конститутивную  экспрессию гена), RolD промотора из Agrobacterium rhizogenes (обеспечивает транскрипцию гена только в тканях корня) и PRB-1b промотора из табака (промотор белка, ассоциированного с патогенезом). Исследовалась способность полученных трансгенных растений расти в присутствии некоторых  тяжелых металлов (кадмий, кобальт, цинк, никель, свинец, медь). При этом трансгенные растения были менее подвержены негативному влиянию этих металлов по сравнению с нормальными нетрансгенными растениями. Сходные результаты были получены S. Shan et al., 2005, при исследовании способности трансгенных растений рапса, экспрессирующих ген acdS под контролем 35SCaMV или RolD, расти в присутствии повышенных концентраций никеля.

E. Sergeeva et al., 2006, показали, что  трансгенные растения рапса, экспрессирующие acdS ген под контролем 35SCaMV, RolD или PRB-1b промоторов, более устойчивы к солевому стрессу, чем нормальные растения. В ходе эксперимента растения выращивали в среде, содержащей 0-200 мМ NaCl.

1.3.1. Влияние бактериального гена acdS  на солеустойчивость растений

Увеличение продукции  этилена в ответ на засоленность было продемонстрировано на томатах  и огурцах. Основываясь на данных результатах, Abeles ввел термин "стрессовый этилен". Увеличение концентрации соли приводит к уменьшению осмотического потенциала среды роста, что приводит к снижению возможности поступления воды. Механизм ответа на солевой стресс, как полагают, частично подобен механизму ответа на засуху. Явное повышение продукции этилена было отмечено в ответ на засыхание отдельных листьев. С другой стороны, когда Morgan и Drew исследовали, что повышение продукции этилена произошло в ответ на быстрое высыхание, в то время как медленное высыхание не вызывает повышенной продукции этилена, этот результат был интерпретирован, так, что стимулированное производство этилена – это ответ на ранение. С другой стороны, Mayak  исследовал, что повышение продукции этилена в срезанных цветах гвоздики произошло во время периода восстановления, который следовал за периодом сушки; таким образом, этилен – это строго ответ на ранение. Данные, приводимые в обзоре литературы, указывают на то, что растения различаются по тому, сколько этилена вовлечено в ответ на абиотический стресс. Некоторые растения отвечают на стресс повышением продукции этилена, в то время как в других растениях продукция этилена остается неизменной. (Mayak S., Tirosh T., Glick B.R, 2004)

Рост трансгенного канола (Brassica napus), экспрессируюшего ген  фермента 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат дезаминаза, был  сравнён с нетрансгенным канола, незащищённым от нарастающей и определённой солевой концентрации Ni в определённой среде.. Трансгенный канола и канола, обработанный  Pseudomonas putida UW4, имели большую биомассу побегов по сравнению с нетрансгенным канола при условиях небольшого нарастания стресса. При условиях высокого нарастания стресса была уменьшена биомасса побегов, а накопление Ni было увеличено по сравнению с опытами относительно низких условий нарастания стресса. Это первая полевая практика, которая регистрирует увеличение устойчивости растения, используя трансгенные растения и бактерий, ускоряющих  рост растений (PGPB), подвергая их множественным стрессам. (Farwell AJ, Vesely S, Nero V, Rodriguez H, McCormack K, Shah S, Dixon DG, Glick BR., 2005)

Pseudomonas fluorescens штамма TDK1, обладающая AЦК-дезаминазной активностью,  улучшает устойчивость  растений  арахиса к солям, что в свою  очередь приводит к увеличению  урожая у таких растений по  сравнению с растениями арахисами, обработанных штаммами Pseudomonas, не обладающими AЦК-дезаминазной активностью. Это исследование будет полезно в целях использования активности AЦК-дезаминазы от штаммов микроорганизмов против различных биотических и абиотических стерессов, где накопился АЦК в качестве предшественника для этиленового биосинтеза. (Saravanakumar D, Samiyappan R, 2007)

1.3.2. Влияние бактериального гена acdS  на устойчивость растений к тяжёлым металлам и органическим соединениям

Было исследовано  прорастание семян канола (Brassica napus), обработанных   бактериями обеспечивающими  рост растения (PGPB), в почве, загрязненной медью и полициклическими ароматическими углеводородами. Бактерии Pseudomonas asplenii AC, выделенные из загрязнённой полициклическими углеводородами почвы, был трансформированы, после чего приобрели способность экспрессировать бактериальный ген, кодирующий АЦК-дезаминазу. Затем бактерии дикого типа и трансформированные бактерии были протестированны на стимуляцию роста у растений. Проростки, выращенные в присутствии меди или креозота, а также в присутствии батерий дикого типа и  трансформированных бактерий P. Asplenii AC, значительно увеличивали  биомассы корня и побега. Природные и трансформированные P. asplenii AC  были одинаково эффективны в обеспечении роста растения в загрязненных медью почвах. Однако в почвах, загрязненных креозотом, природные бактерии были менее эффективными. (Reed ML, Glick BR., 2005)

Чтобы проверить, могут ли бактерии стимулировать  рост тростника Phragmites australis в присутствии металлов и органических соединений, семена P. australis были обработаны почвенными бактериями. Бактерия Pseudomonas asplenii АС была генетически трансформирована, после чего она  приобрела способность экспрессировать бактериальный ген, кодирующий фермент АЦК-дезаминазу, а затем природная и трансформированная бактерии были протестированы на P. australis. Обработанные бактериями семяна тростника были впоследствии выращены в присутствии меди и креозота. Скорость прорастания семян, обработанных трансформированной  P. asplenii АС, значительно увеличилась. (Reed ML, Warner BG, Glick BR, 2005)

1.3.3. Влияние бактериального гена acdS повышение устойчивости растений томатов и клещевины обыкновенной к образованию и развитию галлов

Многие бактерий, стимулирующие   рост растения, кодируют фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат дезаминазу, который может деградировать АЦК, непосредственный предшественник этилена в растениях, с образованием  α-кетобутирата и аммиака, и таким образом понижать  уровни этилена в растении. Чтобы изучить эффект АЦК-дезаминазы в  развитии  корончатых галлов, ген АЦК-дезаминазы из  Pseudomonas putida UW4 был введен в клетки Agrobacterium tumefaciens C58 В этих экспериментах было показано, что присутствие АЦК-дезаминазы ингибирует развитие опухоли как у томатов, так и у растений клещевины обыкновенной. (Hao Y, Charles TC, Glick BR., 2003)

Влияние бактериального гена acdS  на укоренение отводок гвоздики

Гводзика обрабатывалась нетрансформированной и трансформированной АЦК-содержащей бактерией Azospirillum brasilense Cd1843.Обработанные бактериями, отводки гвоздики продуцировали значительно больше корней, чем необработанные отводки гвоздики, взятые в качестве контроля, и чуть меньше корней, чем отводки, обработанный 0,1 % индолилмасляной кислотой. Корни у отводок гвоздики, обработанных АЦК-содержащими  Azospirillum brasilense Cd1843, были самыми длинными  в отличие от отводок, обработанных нетрансформированными Azospirillum brasilense, 0.1 % раствором индолилимасляной кислоты  и  водой. Результаты объясняются ранее предложенной моделью бактериального стимулирования роста растений АЦК-дезаминазой и индолилиуксусной кислоты, и могут иметь значения для использования бактерий в цветочной промышленности. (Li Q, Saleh-Lakha S, Glick BR, 2005)

Влияние бактериального гена acdS  на образование клубеньков у люцерны

АЦК-дезаминаза была найдена у различного рода ризобактерий, включая микоризообразующих. АЦК-дезаминаза Rhizobium leguminosarum 128C53K, как ранее сообщалось, увеличивает образование клубеньков у гороха. Структурный ген АЦК-дезаминазы (acdS) и его регуляторный ген, ген лейцин-зависимого регуляторного белка (lrpL) от R. leguminosarum  128C53K, были введены в Sinorhizobium meliloti, которые не синтезируют этот фермент, двумя различными способами: через  плазмидный вектор и in situ путём замещения транспозона. Получившиеся штаммы S. meliloti, синтезирующие АЦК-дезаминазу,  показали на 35 - 40 % большую эффективность в образовании клубеньков у  Medicago sativa (люцерна) посредством уменьшения производства этилена у растений-хозяев. Кроме того, бактерии штаммов S. meliloti, синтезирующие АЦК-дезаминазу, были более конкурентоспособным в использовании для стимуляции образования клубеньков у растений, чем штаммы бактерий дикого типа. (Ma W, Charles TC, Glick BR., 2004)

1.3.4. Влияние бактериального гена acdS повышение устойчивости растений гороха (Pisum Sativum) к засухе

Уменьшение  содержания воды в почве стимулирует  производство гормона этилена и  подавляет рост растения. Стратегии, нацеленные на уменьшение развития стрессового этилена могли бы уменьшить его отрицательные эффекты. Растение гороха (Pisum sativum) обработали ризосферными бактериями Variovorax paradoxus 5C-2, содержащими фермент АЦК-дезаминазу. Показано, что обработка растений указанным штаммом приводит к увеличению роста и урожайности растений в условиях засухи. Бактериальный эффект  проявлялся в предотвращении уменьшения  содержания азота в семени вызванного засухой. Применение этого штамма увеличило урожай и пищевую ценность растений, выросших в условиях недостатка влаги. Показано, что использование таких бактерий экономически выгодно, так как это позволяет более эффективно использовать в сельском хозяйстве воду для полива. (Belimov AA, Dodd IC, Hontzeas N, Theobald JC, Safronova VI, Davies WJ., 2009)

Был проведен ряд  экспериментов для оценки эффективности  ризобактерий, содержащих АЦК-деаминазу, на усиление роста гороха при условиях засухи. Три штамма ризобактерий, обладающих АЦК-деаминазной активностью (Pseudomonas fluorescens biotype G (ACC-5), P. fluorescens (ACC-14), and P. putida biotype A (Q-7) были отобраны для исследования их влияния на рост гороха в условиях засухи. и корневой колонизации. Обработанные и необработанные (контрольные) бактериальными штаммами семена гороха  были посеяны в горшки (4 семени / горшок) с различным уровнем влажности почвы (25 %, 50 % , 75 % и 100 %). Результаты показали, что снижение уровня влажности почвы (от 100 до 25%) привело к значительному снижению роста и развития растений гороха. Вместе с тем, семена гороха обработанные ризобактериями, содержащими АЦК- деаминазу, значительно уменьшили предсказываемые последствия стресса. При самом низком уровне влажности (25% ) растения, обработанные Pseudomonas fluorescens biotype G (ACC-5) имели максимальное увеличения биомассы, длины корня, длины стебля, количества листьев (45 %, 150 %, 92 %, 45 % соответственно) по сравнению с контрольными растениями. Весьма вероятно, что ризобактерии, содержащие АЦК-дезаминазу, понизили влияние стрессового условия на опытные растения, что привело к улучшению роста даже при низких уровнях влажности. Таким образом, обработка растений ризобактериями, содержащих АЦК-дезаминазу, могла бы быть полезна в устранении ингибирующего воздействия засухи на рост гороха и других сельскохозяйственных растений. (Zahir ZA, Munir A, Asghar HN, Shaharoona B, Arshad M., 2008)