Стерилизация питательных средств

ГЛАВА 5. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ  СРЕД

В микробиологии используют, как  правило, только стерильные питательные  среды.

23В настоящее время известно  много способов их стерилизации, которые разделяют на две

основные группы: термическую и  холодную стерилизацию.

Из термических способов наиболее широко используются стерилизация насыщенным

паром под давлением (автоклавирование), стерилизация текучим паром, тиндализация и

кипячение.

Стерилизация насыщенным паром  под давлением –– один из наиболее эффективных

методов, основанный на прогревании  субстрата насыщенным паром в  автоклавах –– аппаратах,

работающих под давлением выше атмосферного, так как с повышением давления пара повышается

и его температура (табл.3).

Таблица 3

Температура насыщенного пара при  различных давлениях

Избыточное давление, атм Температура,

о

С

0,5 112

0,6 114

0,7 116

0,8 117

1,0 121

1,5 127

2,0 134

Совместное действие высокой температуры  и пара обеспечивает надежность стерилизации:

при автоклавировании погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Среды, предназначенные для стерилизации в автоклаве, наливают не выше половины

высоты сосуда, сосуд закрывают  ватно-марлевой пробкой или резиновой  пробкой, которую

завальцовывают.

Температура и длительность автоклавирования определяются прежде всего составом

питательной среды. Обычно стерилизация проводится при температуре 121

о

С в течение 15 минут.

Тем не менее необходимо помнить, что такая стерилизация не всегда является безвредной для

питательной среды: длительное автоклавирование при повышенном давлении часто приводит к

гидролизу в ее составе некоторых  питательных компонентов.

Питательные среды, в составе которых  имеются термолабильные вещества, стерилизуют

при более низких температурах и  давлении –– 112

о

С (т.е. 0,5 атм) в течение 15 мин. При таком

режиме стерилизуют, например, среды, содержащие углеводы, пивное сусло, некоторые витамины,

молоко, желатин.

При выборе режима стерилизации необходимо учитывать не только состав среды, но и

уровень ее кислотности или щелочности –– рН. В случае кислой реакции или повышенной

щелочности могут подвергаться гидролизу полимерные компоненты среды. Так, при стерилизации

в автоклаве среды, содержащей желатин, при рН ниже 6,0 происходит пептонизация желатина, в

результате чего среда не затвердевает даже при охлаждении. При рН ниже 5,0 частично

гидролизуется и агар-агар, утрачивая свойство образовывать плотный гель. В процессе

стерилизации среды, имеющей щелочную реакцию, карамелизуются углеводы, выпадают в осадок

соли некоторых металлов.

Чтобы избежать подобных явлений, желательно стерилизовать среды при нейтральном

значении рН, а после автоклавирования подкислить или подщелочить их с помощью стерильных

растворов кислот или щелочей соответственно. Кроме того, некоторые компоненты среды

стерилизуют при таком значении рН и таком режиме, при которых они практически не

изменяются, а затем их добавляют  стерильно в среды в нужном количестве.

На всех этапах процесса стерилизации необходимо вести контроль за режимом по таким

критериям, как давление и температура. Для наблюдения за давлением в  автоклаве пользуются

манометрами, которые периодически проходят поверку.

Для контроля за температурой пользуются химическими термотестами, которые

представляют собой вещества, изменяющие свой цвет и(или) физическое состояние после

воздействия определенной температуры. Запаянные ампулы с порошком, смешанным  с краской,

24или вещества, плавящиеся только  при определенной температуре,  помещают в стерилизационную

камеру вместе с питательными средами, подлежащими стерилизации. При достижении в камере

определенной температуры порошок  плавится, образуя сплав, окрашенный в цвет добавленной

краски, или плавящиеся вещества приобретают  иное состояние –– из кристаллического, переходят

в аморфное со спонтанным изменением окраски, или только плавятся (табл.4).

Таблица 4

Наименование Температурный параметр,

подлежащий контролю,

о

С

Цвет расплавленного

индикаторного вещества

Резорцин, фуксин кислый 110 + 2 Фиолетовый или темно-красный

Бензойная кислота,

Фуксин кислый 120 + 2 Фиолетовый

или темно-красный

Бензамид, фуксин кислый 124 + 3 Фиолетовый

Сукцинамид, фуксин кислый 124 + 2 Фиолетовый

или темно-вишневый

Никотинамид, фуксин кислый 132 + 2 Фиолетовый

или темно-вишневый

Мочевина, фуксин кислый 132 + 2 Фиолетовый

или темно-вишневый

Левомицетин, фуксин кислый 160 + 2 – 10

Темно-красный

или фиолетовый

Лактоза, фуксин кислый 170 + 3 Темно-коричневый

или темно-фиолетовый

Тиомочевина 180 + 2– 10

Желтый или желто-зеленый

Гидрохинон 180 + 2– 10

Серый с фиолетовым оттенком

Кислота винная 180 + 2– 10

Светло-коричневый или коричневый

Более надежным методом контроля эффективности  стерилизации является применение

биоиндикаторов. Для проведения такого контроля в стерилизационную камеру, одновременно со

средами, подлежащими стерилизации, помещают биотесты –– пробирки с полосками марли или

фильтровальной бумаги, зараженные микроорганизмами с известной устойчивостью  к

температурным воздействиям. Обычно для этой цели используют бактерии рода Bacillus –– B. subtilis или B.stearothermophilus. После окончания стерилизации биотесты направляют в

лабораторию, где пробирку с биотестом  заливают сахарным бульоном и посевы инкубируют 48 ч при 37 оС. При наличии визуального роста готовят мазки для идентификации культуры.

Для контроля стерильности питательные  среды после стерилизации помещают в термостат

при 37оС на 5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще агаризованных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности,

производят химический контроль готовых  сред, для чего в нескольких образцах каждой серии

определяют рН, количество общего и аминного азота, хлоридов и др.

Кроме того, каждая среда должна пройти биологический контроль. Для этого  несколько

образцов среды засевают лабораторной культурой того микроорганизма, для  которого

приготовлена среда, и изучают  характер его роста. Только после  всех видов контроля среды можно

использовать по назначению.

25Стерилизация текучим паром  применяется для стерилизации  сред, содержащих

вещества, разлагающихся при температуре выше 100

о

С (аммиачные соли, молоко, желатин,

картофель, некоторые углеводы). Стерилизацию проводят в автоклаве при открытом спускном

кране и незавинченной крышке или в аппарате Коха. Флаконы или колбы со средой загружают в

камеру неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта их с паром. Началом

стерилизации считается время  с момента закипания воды и  поступления пара в стерилизационную

камеру. Обработку питательных  сред текучим паром проводят по 15 – 30 минут ежедневно в

течение 3 дней подряд. При первой стерилизации погибают вегетативные формы

микроорганизмов, некоторые споры  при этом сохраняются и прорастают в вегетативные особи в

процессе хранения питательных сред при комнатной температуре. Последующая стерилизация

достаточно надежно обеспечивает стерильность среды.

Тиндализация –– дробная стерилизация с применением температуры ниже 100

о

С,

предложенная Тиндалем. Тиндализация применяется для стерилизации питательных сред,

имеющих в своем составе вещества, легко разрушающиеся при высокой  температуре (сыворотки,

витамины).

Прогревание стерилизуемой питательной  среды производят в водяной бане, снабженной

терморегулятором, по часу, при температуре 60 – 65

о

С в течение 5 дней или при 70 – 80

о

С в

течение 3 дней.

В промежутках между прогреваниями среды выдерживают при температуре 25 – 37

о

С для

прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Следует учитывать, что эффективность  тиндализации, как и в ряде случаев  стерилизации

текучим паром, зависит от того, прорастают ли споры. Поэтому она не достигает  цели, если споры

находятся в среде, непригодной  для роста или содержащей ингибиторы, или если среда в

промежутках между нагревами инкубируется при температуре, неблагоприятной для прорастания

спор.

Холодная стерилизация. Основными  способами холодной стерилизации являются

различные типы фильтрования и облучения. Такой стерилизации подвергают растворы веществ,

которые при нагревании разрушаются  или существенно изменяют свои свойства. К ним относятся

многие витамины, антибиотики, ферменты, сыворотки, лекарственные препараты  и др.

Стерилизация фильтрованием

Для стерилизации фильтрованием используют фильтры, изготовляемые из материалов с

различными физико-химическими  свойствами, пропускной и адсорбционной  способностями.

В микробиологической практике наиболее широко применяются фильтры мембранные,

асбестовые (фильтры Зейца), фарфоровые (фильтры-свечи) и стеклянные различных конструкций.

Область применения фильтров определяется, главным образом, диаметром их пор. О

пригодности фильтра для стерилизации судят не только по имеющемуся на нем  индексу, но и

путем предварительной (контрольной) фильтрации через него суспензии  относительно небольших

бактерий, например, P.aeruginosa, P.diminuta, S. marcescens.

Мембранные фильтры представляют собой диски различного диаметра и толщиной 0,1 –

0,5 мм, изготовляемые из ацетата  целлюлозы и нитроцеллюлозы, ацетилцеллюлозы,  полиамида и

различающиеся по диаметру пор.

Для стерилизации могут использоваться отечественные фильтры марок  МФА-МА. МФА-А

с размерами пор от 0,20 до 0,45 мкм. Известная фирма «Миллипор» (Франция) выпускает фильтры

с диаметром пор от 0,01 до 14,0 мкм; фирма «Синпор» (Чехословакия) –– от 0,02 до 1,0 мкм.

Мембранные фильтры с диаметром  пор 0,1 мкм и меньше называются ультрафильтрами  и

используются для выделения  вирусов и высокомолекулярных белков.

К достоинствам мембранных фильтров относится сравнительно высокая  скорость

фильтрования и малая адсорбционная  способность (способность задерживать  кроме клеток

различные вещества), а основным недостатком –– непригодность для длительного фильтрования,

т.к. сравнительно быстро закупориваются поры. Так, при диаметре фильтра 35 мм возможно

простерилизовать в среднем 10 мл раствора. Мембранные фильтры используют однократно.

Асбестовые фильтры известны под  названием фильтров Зейца. Их изготавливают из

смеси асбеста с целлюлозой в  виде плотных пластинок различной  толщины (от 4 до 6 мм) и

диаметра (от 35 до 140 мм). Размер пор  от 0,8 до 1,8 мкм.

Плотность фильтров обозначается индексами, указанными на фильтрах (табл.5).

26Таблица 5

Асбестовые фильтры

Индекс фильтра Диаметр пор, мкм

ЕК

EKS

EKS-1

ЕКП

1.5 – 1,8

1,2 – 1,5

1,0 – 1,2

0,8 – 1,0

Асбестовые фильтры дешевы, доступны, характеризуются высокой емкостью поглощения.

Однако следует учитывать, что  в процессе фильтрования из этих фильтров в фильтрат могут

выделяться щелочи, соли щелочных металлов, а иногда и соли железа, они способны

адсорбировать различные вещества из фильтруемой жидкости.

Асбестовые фильтры, как и мембранные, используются однократно.

Стеклянные фильтры представляют собой двуслойные диски из мелкопористого стекла,

впаянные в стеклянные воронки-держатели  разной формы. Особенно широко известны фильтры

Нутча и Бюхнера.

Наибольший размер пор у стеклянных фильтров –– 200 – 400 мкм, наименьший ––

1 – 1,5 мкм. Для стерилизации  используются фильтры с диаметром  пор, не превышающим

1 – 1,5 мкм.

В отличие от асбестовых, они обладают меньшей адсорбционной способностью, не

загрязняют фильтрат.

Из-за нестандартности размеров пор  фильтры из стекла перед употреблением  должны быть

проверены на стерилизующий эффект, а перед повторным использованием необходима их

специальная и весьма длительная обработка.

Фарфоровые фильтры, известные  как свечи Шамберлана, Беркефельда, изготавливают из

фарфора, кремнезема, каолина с  примесью песка и с порами разного  размера, и обозначаемые

марками L1, L2 ……L13 (чем крупнее поры, тем меньше индекс). Для бактериологических целей,

как правило, используют свечи марок L5-L7.

Основные недостатки свечей –– непрочность, низкая скорость фильтрации, быстрая

закупорка пор и сложность (или  невозможность) регенерации. К тому же механизмом их

фильтрующего действия является адсорбция.

Стерилизацию питательных сред или растворов отдельных их компонентов  проводят под

вакуумом, который создают вакуумным  или водоструйным насосом.

Стерилизация облучением

Летальное действие на клетки микроорганизмов  оказывают многие виды излучений ––

ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, α-, β- и γ- лучи радиоактивных элементов и другие.

Чувствительность микроорганизмов  к облучению зависит от очень  многих факторов ––

источника излучений, времени экспозиции, вида микроорганизма, его концентрации и

физиологического состояния, состава  среды, в которой он находится, и  многое другое.

В целях стерилизации используют УФ-облучение с длиной волны 254 нм, однако, его

применение ограничено из-за малой  проникающей способности. От УФ-лучей микроорганизмы