Селекция биотехнологических объектов

    Главным критерием при выборе биотехнологического объекта (в нашем случае микроорганизма-продуцента) является способность синтезировать целевой продукт. Однако помимо этого, в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые порой бывают очень и очень важными. В общих словах микроорганизмы должны:

    • обладать высокой скоростью роста;

    • утилизировать необходимые для их жизнедеятельности дешевые

    субстраты;

    • быть резистентными к посторонней микрофлоре, т. е. обладать высокой конкурентоспособностью.

    Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого продукта.

    Неотъемлемым  компонентом в процессе создания наиболее ценных и активных продуцентов, т. е, при подборе объектов в биотехнологии, является их селекция.

    Селекция - направленный отбор мутантов (организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение). Селекционная работа с микроорганизмом состоит в поиске природных форм, которые обладают какими-либо полезными для человека свойствами (например, синтез БАВ, высокая скорость роста, способность усваивать дешевые среды и так далее), в дальнейшем совершенствовании его, в создании на его основе промышленных штаммов. А генеральным путем селекции является сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора нужного продуцента. В развитии микробных технологий в свое время сыграли очень важную роль методы, базирующиеся на селекции спонтанно возникающих измененных вариантов, характеризующихся нужными полезными признаками. При таких методах обычно используется ступенчатая селекция: на каждом этапе отбора из популяции микроорганизмов отбираются наиболее активные варианты (спонтанные мутанты), из которых на следующем этапе отбирают новые, более эффективные штаммы.

    Для выявления мутаций служат селективные  среды, на которых способны расти  мутанты, но погибают родительские клетки дикого типа. Проводится также отбор  по окраске и форме колоний, скорости роста мутантов и диких форм и  т. д.

    Мутационно-ступенчатый отбор – при этом отборе повышается частота мутаций. С помощью этого метода удалось добиться увеличения активности продуцента пенициллина в 100 000 раз за счет амплификации (умножения) генов, кодирующих образование LLD- трипептида.

      Таким путем за длительное  время были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых дрожжей, пропионовокислых бактерий и др. Ограниченность метода селекции, основанного на спонтанных мутациях, связана с их низкой частотой, что значительно затрудняет интенсификацию процесса. Изменения в структуре ДНК происходят редко. Ген должен удвоиться в среднем 106-108 раз, чтобы возникла мутация. Примером отбора наиболее продуктивных мутантов при культивировании в непрерывном режиме является отбор дрожжей по признаку устойчивости к этанолу, продукту жизнедеятельности дрожжей. . В 1983 г. С.Браун и С.Оливер использовали методы селекции для отбора мутантных штаммов дрожжей, устойчивых к высоким концентрациям конечного продукта (10 %-го этанола), при культивировании их в непрерывном режиме (650 ч). Многолетняя селекция штаммов-продуцентов пенициллина позволила увеличить удельную активность антибиотика в культуральной среде в 400 раз, а штаммов бактерий, синтезирующих кобаламин, — в 10 раз. Отбор по продуктивности (например, продуцентов антибиотиков) осуществляется по степени угнетения роста чувствительного штамма. Дня этого штамм-продуцент высевается на «газон» чувствительной культуры. По размеру пятна, где отсутствует рост чувствительного штамма вокруг колонии штамма-продуцента, судят о степени его активности (в данном случае антибиотической). Для размножения, естественно, отбираются наиболее продуктивные колонии.

    Процесс селекции наиболее эффективных продуцентов  значительно ускоряется при использовании метода индуцированного мутагенеза. Экспериментальное получение мутаций открывает почти неограниченные перспективы для создания высокопродуктивных штаммов. Вероятность возникновения мутаций у микроорганизмов ниже, чем у всех других организмов. Но вероятность выделения мутаций по данному гену у бактерий значительно выше, чем у растений и животных, поскольку получить многомиллионное потомство у микроорганизмов довольно просто и сделать это можно быстро.

    Индуцируемый  мутагенез - путь совершенствования биообъектов радикальными методами. К таким методам относятся:

    - обработка биообъекта химическими  мутагенами, нацеленными на ДНК  или ДНК-тропными агентами. После этой обработки число мутантов резко возрастает, как «положительных» так и « отрицательных». При этом у части мутантов резко изменяются признаки, причем, чем больше доза мутагена, тем больше и летальных, не нужных мутантов, но одновременно и больше процент выживших мутантов. Необходимо, чтобы сохранялся баланс между летальными мутациями и количеством выживших мутантов.

    1. Химические мутагены:

    а) нитрозогуанидин – алкилирует основания в репликативной вилке, вызывает мутации по типу трансверсии, транзиции и делеции,

    б) нитрозометилмочевина – вызывает трансверсию

    в) акридиновые красители (акридиновый  оранжевый) – вставка другого  гена между основаниями

    г) некоторые противоопухолевые антибиотики, которые являются ДНК-тропными агентами.

    2.Физические  мутагены:

    а) УФ- облучение, при этом образуются димеры пиридиновых оснований, идут мутации по типу транзиции и трансверсии. Изменяется порядок считывания генов на уровне трансляции.

    б) рентгеновское облучение

    в) быстрые нейтроны

    г) g-лучи (Со)

    д) ультразвук.

    Однако  и этот прием в селекции не лишен недостатков, главным из которых является его трудоемкость и отсутствие сведений о характере изменений, поскольку экспериментатор ведет отбор по конечному результату. Например, устойчивость организма к ионам тяжелых металлов может быть связана с подавлением системы поглощения данных катионов бактериальной клеткой, активацией процесса удаления катионов из клетки или перестройкой системы (систем), которая подвергается ингибирующему действию катиона в клетке.

    Методы  современной селекции – это генетическое конструирование, когда можно изменить генетическую программу микроорганизма. Используют различные способы рекомбинирования генов: конъюгацию, трансдукцию, трансформацию и другие генетические процессы. Например, конъюгация (обмен генетическим материалом между бактериями) позволила создать микроорганизм, способный утилизировать углеводороды нефти

    Генетическое  конструирование  в живой клетке in vivo включает получение и выделение мутантов с использованием различных способов обмена наследственной информацией живых микробных клеток.

    Генетическое  конструирование  in vitro основано на применении генетической инженерии, которая манипулирует выделенной из организма ДНК.

    Каждый  организм имеет свой генотип и  фенотип. Биотехнолог для совершенствования биообъекта использует:

    • наследственные изменения фенотипа, которое передается по

    наследству;

    • наследственное изменение генотипа.

    Наследственные  изменения называются мутациями в геноме, но есть и внехромосомные изменения. Таким образом мутации проявляются на субклеточном и молекулярном уровне. Хромосомные мутации включают три основных типа:

    1. изменение числа хромосом

    2. изменение числа  и порядка расположения  генов(дупликация – удвоение генов, амплификация – умножение отдельных генов или группы генов, делеция (стирание) – выпадение участков хромосомы или нескольких генов, инверсия – изменение порядка расположения генов на хромосоме, при этом может быть утрата одних функций и приобретение новых).

    3. изменения индивидуальных  генов (внутригенные изменения)

    Внутригенные мутации:

    • точечные – изменение последовательности нуклеотидов в пределах одного гена.

    • транзиция или трансверсия – выпадение или вставка одного или нескольких оснований, например, транзиция – пурин замещается на пурин или пиримидин на пиримидин, трансверсия – пурин замещается на пиримидин.

    Точечные  мутации приводят к замене одной  аминокислоты в белке на другую или  к изменению конформации белковой молекулы, что может привести к потере активности фермента. Если белок регулятор или репрессор, то это может привести к повышению выработки целевого продукта продуцентом.

    В селекции микроорганизмов основное значение имеют два последних типа мутаций.

    Важной  характеристикой мутантов является их способность к реверсии, то есть возвращения к исходному фенотипу (обратное мутирование).

    Мутанты, которые появляются в результате реверсии называются ревертантами

    Современная селекция основана на выделении клоновых культур.

    Определение клона: клон – это генетически однородное потомство одной клетки (это колония, выросшая из одной клетки). Клоновая культура, имеющая наследственную однородность, называется штаммом.

    Важным  подходом в селекционной работе с  микроорганизмами является получение  рекомбинантов путем слияния протопластов, или гибридизации, разных штаммов бактерий. Слияние протопластов позволяет объединить генетические материалы таких микроорганизмов, которые в естественных условиях не скрещиваются.

    Цели, которые необходимо достигать биотехнологу при совершенствовании продуцента:

    1. Увеличение продуктивности в  достижении большого выхода лекарственных веществ на единицу биомассы.

    2. Придать продуценту способность  использовать менее дефицитные  и более дешевые среды.

    3. Продуцент не должен ретроингибировать биосинтез конечного продукта.

    4. Устойчивость продуцента к вирусным  инфекциям (бактериофагам).

    5. Нетребовательность к оборудованию, т.е. биосинтез не должен снижаться при несовременной технологии оборудования (например, достижение меньшей вспениваемости культуральной жидкости)

    6. Оптимизация свойств продуцента  в аспекте медицинской промышленности (продуцент не должен иметь неприятного запаха и т.д.) 

    .