Ріст і розмноження мікроорганізмів

Як уже  зазначалося вище, більшість бактерій розмножуються нестатевим шляхом і  існують у гаплоїдному стані. Однак ще 1946 р. Дж. Ледерберг і  Е. Татум виявили передавання  генетичного матеріалу від однієї клітини до іншої шляхом безпосереднього контакту під час культивування двох штамів кишкової палички, що пізніше дало можливість встановити наявність статевої диференціації у бактерій. Цей процес було названо кон'югацією. Вона нагадує редукований статевий процес.

3. Технологічні основи біотехнологічних виробництв 

Найважливішим завданням будь-якого біотехнологічного  процесу є розробка й оптимізація  технології й апаратури для нього. При організації біотехнологічних виробництв частково був запозичений  досвід розвиненої на той час хімічної технології. Однак біотехнологічні  процеси мають істотну відмінність  від хімічних у силу того, що в  біотехнології використають більш  складну організацію матерії - біологічну. Кожний біологічний об'єкт (клітка, фермент) - це автономна саморегулююча  система.  

Природа біологічних процесів складна й  далеко не з'ясована остаточно. Для  мікробних популяцій, наприклад, характерна істотна гетерогенність по ряду ознак - вік, фізіологічна активність, стійкість  до впливу несприятливих факторів середовища. Гетерогенність також може бути обумовлена наявністю поверхонь фаз і  неоднорідністю умов середовища.  
У загальному виді будь-який біотехнологічний процес включає три основні стадії: предферментаційну, ферментаційну й постферментаційну. Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів у загальному виді може бути представлена блок-схемою, у якій зроблена спроба охопити всі варіанти ферментаційних процесів (мал. 1.1). 
Рис. 1.1. Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів (по У.Е. Вієстур і ін., 1987):   
1 - реактор для готування середовищ, 2 - вихровий насос, 3 - апарат для готування твердих середовищ, 4 - паровий стовпчик для підігріву середовищ до температури стерилізації, 5 - видержуватель середовищ при температурі стерилізації, 6 - теплообмінник для охолодження середовищ, 7 - мірник - збірник живильного середовища, 8 - дозатор, 9 - анаеробний ферментер, 10 - глибинний аеробний ферментер, 11 - біокаталітичний реактор, 12 - ферментер для поверхневої твердо фазної ферментації, 13 - те ж для поверхневої рідинної ферментації, 14 - екстрактор, 15 - сепаратор для відділення біомаси, 16 - система локальної автоматики, 17 - плазмолізатор біомаси, 18 - дезінтегратор біомаси, 19 - випарна установка, 20 - фракціонування дезінтегратів, 21 - сушарка й інші апарати для зневоднювання, 22 - апаратури для розфасовки продукту, 23 - іонообмінні колони, апарати для хімічних і мембранних методів виділення, центрифуги, фільтри, кристалізатори й ін. пристрої. Умовні позначки: рН - розчин для корекції рн, П - компоненти й середовища для підживлення, Пос - посівний матеріал, В - стиснене повітря, ПАВ - піногасник, Ср - стерильне живильне середовище, БА – біологічний агент. 
 

На предферментаційній стадії здійснюють зберігання й підготовку культури продуцента (інокулята), одержання  й підготовку живильних субстратів і середовищ, ферментаційних апаратур, технологічної й рециркуліруємої  води й повітря. Підтримка й підготовка чистої культури є дуже важливим моментом предферментаційної стадії, тому що продуцент, його фізіолого-біохімічні характеристики й властивості визначають ефективність усього біотехнологічного процесу.  

У відділенні чистої культури здійснюють зберігання виробничих штамів і забезпечують їх реактивацію й наробіток інокулята  в кількостях, необхідних для початку  процесу. При вирощуванні посівних доз інокулята застосовують принцип масштабування, тобто проводять послідовне нарощування біомаси продуцента в колбах, суліях, далі в серії послідовних ферментерів. Кожний наступний етап даного процесу відрізняється по обсягу від попереднього звичайно на порядок. Отриманий інокулят по стерильній посівній лінії направляється далі в апарат, у якому реалізується ферментаційна стадія.  
Готування живильних середовищ здійснюється у спеціальних реакторах, обладнаних мішалками. Залежно від розчинності й сумісності компонентів середовищ можуть бути застосовані окремі реактори. Технологія готування середовищ значно ускладнюється, якщо в їхній склад входять нерозчинні компоненти.  

У різних біотехнологічних процесах застосовуються різні по походженню й кількостям субстрати, тому процес їхнього готування  варіюється. Тому дозування живильних  компонентів підбирається й здійснюється індивідуально на кожному виробництві  відповідно до Технологічного регламенту конкретного процесу. Як дозуюче встаткування при цьому застосовуються вагові й об'ємні пристрої, використовувані в харчовій і хімічній промисловості. Транспорт речовин здійснюється насосами, стрічковими й шнековими транспортерами. Сипучі компоненти подають у ферментери за допомогою вакуумних насосів. Часто застосовують принцип попередніх сумішей, тобто солі попередньо розчиняють і потім транспортують по трубопроводах, дозуючи їхню подачу по обсягу. У силу виняткової розмаїтості біотехнологічних процесів і застосовуваних для їхньої реалізації середовищ, методів і апаратури розгляд даних елементів далі буде пов'язаний з конкретними біотехнологічними виробництвами.  

Стадія  ферментації є основною стадією  в біотехнологічному процесі, тому що в її ході відбувається взаємодія  продуцента із субстратом і утворення  цільових продуктів (біомас, ендо- і  екзопродуктів). Ця стадія здійснюється в біохімічному реакторі (ферментері) і може бути організована залежно від особливостей використовуваного продуцента й вимог до типу і якості кінцевого продукту різними способами. Ферментація може проходити в строго асептичних умовах і без дотримання правил стерильності (так звана "незахищена" ферментація); на рідких й на твердих середовищах; анаеробне й аеробне. Аеробна ферментація, у свою чергу, може протікати поверхово або глубинно (у всій товщі живильного) середовища. 
Культивування біологічних об'єктів може здійснюватися в періодичному й проточному режимах, напівбезупинно з підживленням субстратом. При періодичному способі культивування ферментер заповнюється вихідним живильним середовищем з інокулятом мікроорганізмів  
 

Протягом  певного періоду часу в апараті  відбувається взаємодія мікроорганізмів  і субстрату, зо супроводжується  утворенням у культурі продукту (Х + SP).  
Біохімічні перетворення в цьому апараті тривають від десятків годин до декількох діб. Регуляція умов усередині ферментера - найважливіше завдання періодичного культивування мікроорганізмів. У ході періодичної ферментації вирощувана культура проходить ряд послідовних стадій: лаг-фазу, експонентну, уповільнення росту, стаціонарну й відмирання. При цьому відбуваються істотні зміни фізіологічного стану біооб’єкта, а також ряду параметрів середовища. 

Цільові продукти утворюються в експонентній (первинні метаболіти - ферменти, амінокислоти, вітаміни) і стаціонарній (вторинні метаболіти - антибіотики) фазах, тому залежно від цілей біотехнологічного  процесу в сучасних промислових  процесах застосовують принцип диференційованих режимів культивування.  

У результаті цього створюються умови для  максимальної продукції того або  іншого цільового продукту. Періодично ферментер спорожняють, роблять  виділення й очищення продукту, і  починається новий цикл.  

Безперервне культивування 
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні переваги перед періодичним. Безперервна ферментація здійснюється в умовах сталого режиму, коли мікробна популяція і її продукти найбільш однорідні. Застосування безперервних процесів ферментації створює умови для ефективного регулювання й керування процесами біосинтезу. Системи безперервної ферментації можуть бути організовані за принципом повного витиснення або повного змішання.

Процес  ферментації здійснюється в довгій трубі, у якій з одного кінця безупинно  надходять живильні компоненти й  інокулят, а з іншого з тією ж  швидкістю випливає культуральна рідина. Дана система проточної ферментації  є гетерогенною.  
При безперервній ферментації у ферментах повного змішання (го-могенно-проточний спосіб) у всій масі ферментаційного апарата створюються однакові умови. Застосування таких систем ферментації дозволяє ефективно управляти окремими стадіями, а також всім біотехнологічним процесом і стабілізувати продуцент у практично будь-якому, необхідному експериментаторові або біотехнологу стані. Керування подібними установками здійснюється двома способами (мал. 1.4). 
  
Турбидостатний спосіб базується на вимірі мутності потоку, який виходить. Вимір мутності мікробної суспензії, викликаний ростом кліток, є мірою швидкості росту, з якою мікроорганізми виходять із біореактора. Це дозволяє регулювати швидкість надходження у ферментер свіжого живильного середовища. Другий метод контролю, - хемостатний, простіше. Керування процесом у хемостаті здійснюється виміром не вихідного, а вхідного потоку. При цьому концентрацію одного з компонентів живильного середовища (вуглець, кисень, азот), що надходить у ферментер, установлюють на такому рівні, при якому інші живильні компоненти перебувають у надлишку, тобто концентрація, що лімітується біогенного елемента обмежує швидкість розмноження кліток у культурі.   
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні переваги перед періодичним.   
Для безперервного (проточного) культивування, на відміну від періодичного, культури характерна постійна подача свіжих живильних компонентів зі швидкістю, рівною швидкості видалення середовища з культури (відкрита система). Якщо культура добре перемішується, то проби, узяті з будь-якої частини ферментера, будуть однакові по біомасі й концентрації субстрату. По складу вони ідентичні також культуральній рідини, що випливає з ферментера.  
При безперервному культивуванні теоретично бактерії ростуть експоненціально в умовах постійної подачі свіжого середовища й видалення частини кліток разом зі старим середовищем, так що обсяг культури згодом не міняється.  
Загалом кажучи, постійна концентрація кліток для безперервного культивування не обов'язкова. Однак у більшості робіт з вивчення кількісних аспектів безперервного культивування описуються системи з постійною концентрацією біомаси. Розглянуті нижче принципи відносяться тільки до безперервного культивування в рівноважному стані. 
Термін "рівноважний стан" часто вживають у літературі у зв'язку з безперервним культивуванням; буквально він означає, що під час дослідження не відбувається зміни стану культури. Насправді це визначення занадто широке, оскільки на практиці при безперервному культивуванні деякі параметри можуть мінятися, тоді, як інші при цьому залишаються постійними. Тому безперервну культуру в рівноважному стані визначають як культуру з постійною концентрацією біомаси в певний період спостереження. На противагу цьому в періодичній культурі постійна концентрація розчиненого кисню підтримується змінами, що відбуваються в середовищі, але зміст у ній біомаси міняється. 
Безперервне культивування в рівноважному стані можливо тільки в тому випадку, коли всі вступні потоки, необхідні для нагромадження біомаси, точно збалансовані з потоками, що беруть участь у виході біомаси із системи. 
Теоретично обсяг чисто безперервної культури не міняється (на практиці він підданий незначним коливанням). Отже, швидкості подачі середовища у ферментер, і виходу культури з нього повинні бути однаковими. Нарешті, оскільки питома швидкість загибелі кліток майже завжди значно менше питомої швидкості їхнього росту, величину швидкості можна не брати до уваги. Виключення із цього правила спостерігається тільки при дуже низьких швидкостях росту мікроорганізмів, у присутності токсичних речовин або у випадку культивування в екстремальних біофізичних умовах. 
Іншими словами, питома швидкість росту популяції у ферментері визначається швидкістю розведення D яка дорівнює p/y.  
Існує багато типів безперервного культивування. В обговоренні ми обмежимося двома основними типами безперервного культивування: "хемостатом", у якому стан рівноваги досягається шляхом регулювання надходження субстратів, що лімітують ріст, і "турбидостатом", у якому стан рівноваги досягається шляхом видалення біомаси й заміщення її свіжим середовищем зі швидкістю, що відповідає росту культури. 
 
Турбидостатний режим культивування 

Турбидостатне культивування являє собою найпростішу  систему безперервного культивування. Концентрація кліток при турбидостатному  культивуванні регулюється постійним  підстроюванням швидкості надходження  живильних компонентів. Концентрацію біомаси в турбидостаті вибирає  оператор, а швидкість розведення й концентрація субстратів підтримується  так, щоб зберігався заданий рівень біомаси. 
Принцип роботи турбидостата заснований на підтримці постійної щільності бактеріальної популяції в апараті, безперервна культура постійно перебуває в найбільш бажаній фазі росту, при якій забезпечується максимальний вихід біологічно важливих з'єднань або біомаси. Турбидостатне культивування здійснюють тоді, коли лімітований фактор не відомий або в ньому немає необхідності, тому субстрат додається у ферментер у надлишку. Надлишок всіх живильних компонентів середовища робить роботу турбидостата стабільною.  

Турбидостат дозволяє регулювати систему в широких  інтервалах концентрації біомаси при  швидкостях розведення, близьких до Dкр. Швидкість розведення в турбидостаті дорівнює питомої швидкості росту  за умови, що X залишається постійною  величиною. Сигналом для подачі й  регулювання швидкості потоку середовища може бути не тільки оптична щільність, але й будь-який параметр середовища, що піддається виміру електродом, що переводить величину вимірюваного параметра у  величину електричного потенціалу.  

Оскільки  основні метаболічні функції (поглинання бактеріями кисню, виділення вуглекислого газу, зміна кислотності), тісно зв'язані  зі швидкістю росту кліток і, в  остаточному підсумку, з питомою  швидкістю росту культури, саме ці показники частіше інших використають як вимірювані змінні при регулюванні  потоку середовища. 

Турбидостатне культивування може здійснюватися  одностадійно й двустадійно, тобто  в одному ферментері або двох послідовно з'єднаних між собою ферментерах.  

Одностадійне  турбидостатне культивування використається для одержання максимальної швидкості  росту. При двустадійному турбидостатному  культивуванні в другому ферментері, можливо, відтворити фазу росту, пов'язану  із синтезом вторинних метаболітів (фазу стаціонарного максимуму). 
При низьких концентраціях субстрату й при низькій концентрації кліток можна повернути у ферментер частину біомаси, що випливає з нього. Повернення підвищує концентрацію кліток і прискорюють процес. Варіантів повернення біомаси може бути кілька. Сепарують культуру, що випливає, і згущену частину повертають у ферментер. Установлюють різні фільтруючі пристрої, що дозволяють випливати культуральній рідини, але затримуючі клітки.  

Турбидостатнмй  режим культивування базується  на прямому контролі концентрації біомаси. Найпоширенішим методом її визначення є вимір світорозсіювання за допомогою  фотоелементів. Підвищення концентрації кліток і відповідно до оптичній щільності  автоматично прискорює проток рідини й навпаки.  

По своїй  конструкції турбидостати відрізняються  від хемостатів лише системами контролю швидкості протоки. Хемостати застосовуються в процесах, що характеризуються малою  протокою, коли концентрація кліток змінюється незначно зі зміною швидкості протоки, що полегшує саморегулювання системи.  

Технічно  найпростіший турбидостат відрізняється  від хемостата тільки наявністю  датчика оптичної щільності й  виконавчого механізму (дозатора живильного) середовища, що включається при досягненні культурою заданої щільності. Оптична  система дозволяє підтримувати стійкий  режим при різниці щільності  до й після розведення на рівні  нижче 1% від заданої щільності, що дозволяє вважати динаміку щільності  практично незмінною й користуватися  диференціальними рівняннями для її формального опису. 
Турбидостат являє собою систему культивування, що включає реактор, у який безупинно подається живильне середовище, з якого відбирається культура. Швидкості подачі середовища й відбору культури повинні бути рівні, що забезпечує сталість обсягу культури.  

Один  з найпростіших варіантів турбидостата з автоматичною підтримкою обсягу культури в реакторі зображений на схемі. Культиватор  для вирощування складається  з освітлюваного реактора (фотореактор), що барботирується газоповітряною сумішшю, що містить вуглекислий газ. Барботаж забезпечує перемішування культури, вуглецеве харчування кліток і відвід кисню. З ємності з живильним  середовищем, з постійно заданою  швидкістю, у реактор надходить  середовище. Через отвір у реакторі, розташований на певній висоті, культура безупинно зливається в ємність  для збору врожаю. Це забезпечує при постійній швидкості доливки  сталість швидкості зливу і їхню рівність. Крім того, така система автоматично  підтримує постійний обсяг культури у фотореакторі. 
Система для турбидостатных культур 
  

Область використання турбидостатів - високі швидкості  розведення, що обумовлюють швидку й різку зміну концентрації біомаси. З технічної точки зору турбидостат  може застосовуватися тільки для  культивування одноклітинних мікроорганізмів. При тривалому культивуванні  в турбидостаті виникає досить серйозна проблема, пов'язана із прилипанням  кліток до фотоелемента.