Роль глутатиона в защите митохондрий от повреждающего воздействия

Минестерство  образования Республики Беларусь

Гродненский Государственный университет имени Янки Купалы

Факультет биологии и экологии

Кафедра биохимии 
 
 
 

Курсовая  работа 
 

Роль  глутатиона в защите митохондрий от повреждающего  воздействия  
 
 

Исполнитель:

студент 4 курса

Порфирьев Павел Сергеевич 
 

Научный руководитель

заведующий кафедры биохимии

доктор  биологических наук

профессор

Заводник  И. Б. 
 
 

Гродно 2007 
Содержание

Введение………………………………………………………………………………… 3

1. Распределение глутатиона по органам и его межорганный транспорт…….……. 4

2. Дисульфидная форма глутатиона и его межорганное распределение…………… 6

3. Определение………………………………………………………………………….  8

4. Функции…...………………………………………………………………………… 10

5. Физиологическая антиоксидантная система……………………………………… 11

6. Обеспечение организма необходимыми антиоксидантами……….……………... 14

7. Всасывание глутатиона…..……………………..……...………………..…………. 15

8. Влияние на  концентрацию глутатиона гипохлорной  кислоты и трет-бутилгидро-

    перекиси……………………………………………………………………………... 19

Заключение...………………………………………………………………………….. 20

Литература…………………….………………………………………………………. 21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение

     Восстановленный глутатион (GSH) — низкомолекулярный  тиол, преобладающий (90–95%) во многих растительных, микробных и во всех животных клетках, в которых его молярная концентрация (1–10 мМ) выше, чем концентрация большинства органических веществ [25]. GSH является трипептидом (L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин), биосинтез и катаболизм которого описываются так называемым глутамильным циклом [26]. Функции глутатиона многообразны: восстановление и изомеризация дисульфидных связей, влияние на активность ферментов и других белков, поддержание мембранных функций, коферментные функции, участие в обмене эйкозаноидов, резервирование цистеина, влияние на биосинтез нуклеиновых кислот и белка, пролиферацию и др. [4]. Однако в данном сообщении будет в основном обсуждаться роль глутатиона как одного из важнейших компонентов системы антиоксидантной защиты у млекопитающих. При этом особое внимание обращается на проблемы поступления эндогенного и «пищевого» глутатиона в желудочно-кишечный тракт, обеспеченности им слизистой оболочки тонкой кишки и ее защиты от продуктов свободнорадикального окисления.  
 

 

 

1. Распределение глутатиона по органам и его межорганный транспорт

     Главный орган синтеза GSH у млекопитающих  – печень. Она обеспечивает около 90% всего циркулирующего глутатиона при физиологических условиях [13]. Уровень глутатиона в печени уменьшается приблизительно в 2 раза при голодании и быстро увеличивается после еды. В печени два пула глутатиона: лабильный, со скоростью турновера 2 ч, и стабильный, со скоростью турновера 30 ч. Большая часть глутатиона печени – цитозольный, обновляющийся очень быстро. Образование глутатиона в печени тесно связано с питанием, особенно с содержанием в диете цистеина. Предполагают, что лабильный пул глутатиона – это резерв в печени цистеина [6]. Поступление глутатиона из печени в плазму крови и желчь стимулируется некоторыми гормонами, в частности глюкагоном и вазопрессином [27]. Глутатион плазмы утилизируется тканями организма путем транспорта через клеточные мембраны и ресинтеза внутри клетки посредством глутамильного цикла. Поступление глутатиона из плазмы крови в ткани контролируется активностью гамма-глутамилтранспептидазы, а ферментом, лимитирующим скорость синтеза глутатиона, является гамма-глутамилцистеинсинтетаза. В этих условиях, если нет значительной физической нагрузки, 80-90% глутатиона захватывается и расщепляется почками вследствие чрезвычайно высокой активности в них гамма-глутамилтранспептидазы; в других тканях и органах (скелетные мышцы, сердце) турновер глутатиона происходит с малой скоростью [12]. При ингибировании синтеза глутатиона в печени и организме в целом уменьшается и концентрация глутатиона в плазме крови. Скелетные мышцы сохраняют плазменный глутатион за счет снижения активности гамма-глутамилтранспептидазы, а в более активных в метаболическом отношении органах, как в сердце и в почках, в ответ на снижение снабжения плазменным глутатионом, напротив, увеличивается активность гамма-глутамилтранспептидазы [23]. С желчью транспортируются также различные конъюгаты глутатиона, образующиеся вследствие его детоксикационного действия на ксенобиотики. Как это происходит? Глутатион-s-трансфераза катализирует реакцию между глутатионом и многими электрофильными метаболитами ксенобиотиков, повышая гидрофильность лигандов и облегчая их экскрецию печенью. Глутатион-s-трансфераза, взаимодействуя с глутатионом, способствует его ионизации до глутатионового тиолатного иона GS–, который нуклеофильно атакует электрофильный атом ксенобиотика. Образующиеся конъюгаты преимущественно метаболизируются почками до меркаптуратов. Деградация конъюгатов ферментами щеточной каймы происходит в три стадии: 1-я – гамма-глутамилтрансфераза «отрывает» гамма-глутамил; 2-я – дипептидаза «удаляет» глицин; 3-я – N-ацилтрансфераза ацетилирует цистеиновый конъюгат с последующим образованием соответствующей меркаптуровой кислоты [4]. Результаты исследований свидетельствуют, что как глутатион, так и его конъюгаты транспортируются из печени, по-видимому, одним и тем же путем [6].

     

     Рис. 1 γ-Глутамилтрансферазный цикл.

     γ-Глутамилтрансфераза  встроена в клеточную мембрану и  осуществляет транслокацию аминокислот  из внеклеточного пространства за счет реакции транспептидирования остатка у-глутаминовой кислоты с глутагиона или другого у-глутамилпептида на транспортируемую аминокислоту и переноса возникшего переносчика, а именно γ-глутамиламинокислотного производного, во внутриклеточное (или внутримембранное) пространство. Здесь благодаря действию у-глутамилциклотрансферазы переносчик распадается на свободную аминокислоту, которая таким образом оказывается перенесенной через мембрану, и пироглутаминовую кислоту, образование которой практически нацело сдвигает реакцию распада дипептида-переносчика вправо. В результате ряда ферментативных процессов (правая часть рисунка) происходит ресинтез глутатиона (или другого γ-глутамил пептида, если он участвует в переносе аминокислот), и цикл может повториться снова [43].

2. Дисульфидная форма глутатиона и его межорганное распределение

     Окисленный  глутатион (GSSG) – низкомолекулярный тиол, выявляемый во всех типах клеток и внеклеточном пространстве. Содержание GSSG в клетках и вне их невелико и жестко регулируется относительно сопряженного с ним соединения – восстановленного глутатиона (GSH), составляя 10-4 – 10-5 М против 10-2 – 10-1 М GSH [32]. Роль GSSG в физиологических процессах рассматривается преимущественно в аспекте клеточных реакций GSH. Повышение содержания GSSG в клетках при различных нарушениях клеточных функций явилось поводом рассматривать его как биологически агрессивную молекулу [33]. Однако работы, выполненные в ряде лабораторий по изучению влияния на клетки GSSG в концентрациях, близких или превышающих те, которые определяются вне клеток, показали способность GSSG оказывать рецепторопосредованное воздействие на клеточные процессы [34-36]. Кроме того, синтетический аналог GSSG – фармакологический препарат Глутоксим® - нашел клиническое применение как иммуномодулятор и гемостимулятор в комплексной терапии бактериальных и вирусных заболеваний [37], псориаза [38,39], лучевой и химиотерапии в онкологии [40]. В норме содержание GSSG в тканях и плазме крови млекопитающих поддерживается на уровнях, во много раз более низких, чем для GSH [16]. Окислительный стресс может привести к существенному накоплению GSSG в печени и его выбросу в кровь [5]. Повышенное содержание GSSG в плазме крови, в свою очередь, может вызвать окисление тиоловых групп белков плазмы и (или) белков базолатеральных мембран клеток ткани и их инактивацию [31]. Очевидно биологическое значение удаления GSSG из циркуляции крови при его чрезмерной аккумуляции. Помимо участия почек и поджелудочной железы предполагается регуляция уровней GSSG, GSH и цистеина путем тиолдисульфидного обмена с цистеином, поступающим из слизистой оболочки тонкой кишки [10]. С желчью экспортируется 50–60% от общего количества глутатиона печени, и так как при нормальных условиях его аутоокисление незначительно, то его концентрация в желчи велика (1–2 мM у крысы). Следовательно, потенциально глутатион желчи — это мощный восстанавливающий фактор метаболических превращений переокисленных жиров в тонкой кишке [7]. Функциональная значимость глутатиона желчи, поступающей в дуоденальный просвет тонкой кишки, состоит в следующем: 1) необходимость для нормального функционирования тонкой кишки в условиях ингибирования синтеза GSH; 2) транспорт через мембрану щеточной каймы и утилизация эпителием слизистой оболочки тонкой кишки в целях детоксикации гидроперекисей жирных кислот; 3) поддержание баланса тиолы/дисульфиды в просвете кишки и регуляция активности ферментов щеточной каймы, содержащих SH-группы; 4) стимуляция всасывания железа и следовых элементов, например селена [9]. Поскольку глутатион и другие тиолы, например цистеин и цистеинилглицин, поступают в просвет тонкой кишки с желчью, нельзя априори не учитывать и то обстоятельство, что они могут секретироваться в просвет тонкой кишки из слизистой оболочки [9]. В просвет тощей кишки у крыс секретируются тиолы из слизистой оболочки. При этом 20–40% от общего содержания тиолов в просвете тощей кишки составляет цистеин и только 3% – глутатион. Однако 40–50% цистеина, обнаруживаемого в просвете тощей кишки, образуется из глутатиона, секретируемого слизистой оболочкой и расщепляемого гамма-глутамилтрансферазой щеточной каймы энтероцитов. Цистеин составляет 15–20% от общего пула тиолов в слизистой оболочке тощей кишки у крыс. Роль тонкой кишки в снабжении глутатионом других органов и тканей (с учетом возможного поступления GSH с пищей) представлена на схеме [11].

3. Определение

     Специфич. метод определения глутатиона основан на его способности активировать превращение метилглиоксаля в молочную кислоту под действием фермента глиоксалазы [41].

     Определение при помощи 5,5'-дитиобис (2-н итробензоата). Как уже отмечалось в главе I, дисульфиды принадлежат к числу наиболее специфических реагентов на SH-группы белков. Среди различных дисульфидов, предложенных для определения SH-rpyпп, наибольшую популярность приобрел реагент Эллмана: 5,5'-дитиобис (2-нитробензойная кислота). При взаимодействии этого реагента с SH-группами белка при рН около 8 образуются окрашенный анион нитротиофенолята и смешанный дисульфид:

Реакция а

Количество образующегося аниона нитротиофенолята определяют по приросту поглощения при 412 нм (ε_М — = 13 600). При благоприятных стерических условиях смешанный дисульфид может реагировать еще с одной SH-группой белка, в результате чего выделяется второй эквивалент аниона нитротиофенолята и образуется белковый дисульфид:

Реакция б

Следует отметить, что как в том случае, когда реакция останавливается на стадии (а), так и тогда, когда протекают обе реакции (а) + (б), на каждую прореагировавшую SH-группу белка выделяется один эквивалент аниона нитротиофенолята. Описанный метод является высокочувствительным и строго специфическим и может быть использован для определения SH-групп как в нативных, так и в денатурированных белках (например, в присутствии додецил-сульфата натрия). В нативных белках с реагентом Эллмана реагирует нередко меньшее число SH-групп, чем с n-меркурибензоатом. К числу недостатков метода относится то, что при длительной инкубации может происходить «аутоокисление» аниона нитротиофенолята. Трудности возникают при использовании реагента Эллмана для определения SH-групп в окрашенных белках, например в гемопротеидах, сильно поглощающих при 412 нм. Следует также иметь в виду, что перед проведением реакции необходимо тщательно удалять из раствора следы тиолов, которые используют для активации или стабилизации некоторых ферментов (это обстоятельство существенно и при других методах количественного определения SH-групп). Для устранения отмеченных трудностей Баттеруорс и др. разработали следующую модификацию метода Эллмана. Белок инкубируют с избытком реагента Эллмана при рН 7—8; в случае необходимости инкубация может быть проведена в присутствии тиола. Инкубационную смесь фильтруют через колонку с молекулярным ситом для отделения белка, содержащего смешанный дисульфид, от избытка реагента и свободного аниона нитротиофенолята. К тиофенилированному белку добавляют затем избыток дитиотреитола, который восстанавливает смешанный дисульфид с освобождением второго эквивалента нитротиофенолята. Количество последнего определяют по приросту поглощения при 412 нм. Окрашенные белки после обработки дитиотреитолом предварительно осаждают 60%-ной надхлорной кислотой и определяют содержание аниона нитротиофенолята в супернатанте после его подщелачивания при помощи 6 н. NaOH. Описанная модификация применима только к тем белкам, реакция которых с реагентом Эллмана останавливается на стадии (а). Если же происходит реакция (б), то модифицированная методика даст ошибочные результаты.

  Среди других дисульфидов, предложенных для  спектрофотометрического определения SH-групп, можно упомянуть р-оксиэтил-2,4-динитрофенил-дисульфид, реакция которого с SH-группами белка протекает согласно следующему уравнению:

О числе  прореагировавших SH-групп судят по приросту поглощения при 408 нм, обусловленному освободившимся динитротиофенолом [44].

4. Функции

     Глутатион найден у животных, растений, микроорганизмов. Он защищает SH-группы ферментов и других белков от окисления; восстанавливает Н2О2 и другие пероксиды, связывает свободные радикалы; участвует в тиол-дисульфидном обмене и в обезвреживании многих чужеродных для организма соединений, восстанавливает рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды, переносит аминокислоты через мембрану клеток, является кофактором ряда ферментов, например глиоксалазы и формальдегиддегидрогеназы [41]. Глутатион ― это соединение, защищающее сульфгидрильные группы гемоглобина и мембрану эритроцитов от окислителей. Участвует в регулировании окислительно-восстановительного потенциала клетки. Повышенное количество глутатиона обнаруживается в клеточных линиях, резистентных к алкилирующим соединениям (эмбихину, хлорбутину, мелфалану, циклофосфамиду, BCN U и др.). Являясь выраженным ингибитором свободнорадикального окисления в высоких концентрациях, глутатион способен оказывать прооксидантный эффект при изменении его концентрации. Глутатион входит в состав питательных формул, а также добавок, которые оказывают на организм очистительное действие, удаляя определенные токсины (например, появившиеся в организме в результате курения). Он, как мощный антиоксидант, защищает от вреда, наносимого токсическими веществами и свободными радикалами (в частности, пероксидами), дымом, радиацией и другими токсинами. Глутатион предотвращает рак, катаракту и кожные заболевания [42].

5. Физиологическая антиоксидантная система

     Глутатион обычно отсутствует у анаэробных микроорганизмов — прокариот  и некоторых эукариот, но есть почти  у всех аэробов, что свидетельствует  в пользу гипотезы о появлении  глутатиона у эукариот в связи  с возникновением аэробного метаболизма  и митохондрий. Уже это дает основание полагать, что глутатион защищает клетки от активных форм кислорода, образование которых – неизбежное следствие аэробной жизни. Само по себе появление свободных радикалов в живом организме – нормальный биологический процесс, и в норме количественные аспекты этого процесса строго регулируются. Кислород, являясь необходимым условием существования аэробных клеток, является и потенциальным постоянным источником возникновения кислородных свободных радикалов. При больших физических нагрузках количество О2 может возрасти в 10 раз [19]. Самопроизвольное аутоокисление в клетке, а также и в неклеточном веществе тормозится физиологической антиоксидантной системой (ФАС) [3]. Эта система включает биоантиоксиданты (БАО), ингибирующие переокисление на начальной стадии образования свободных радикалов липидов (токоферол) или активных форм кислорода (супероксиддисмутаза). Антирадикальное ингибирование осуществляется цепью: глутатион (эрготионеин – серосодержащий бетаин) – аскорбат – токоферол, транспортирующей электроны (в составе атомов водорода) от пиридиннуклеотидов (НАД Н и НАДФ Н) к свободным радикалам. Таким образом обеспечивается стационарный крайне низкий уровень свободнорадикальных состояний липидов и биополимеров в клетке. Наряду с цепью биоантиокислителей, представленной преимущественно витаминами антиоксидантного действия, в системе ингибирования свободнорадикального окисления в живой клетке участвуют ферменты, осуществляющие окислительно-восстановительное превращение глутатиона и аскорбата (глутатионзависимые редуктаза и дегидрогеназа), а также ферменты, расщепляющие перекиси. Функция двух обоих механизмов, посредством которых действует физиологическая антиоксидантная система, осуществляется как цепью биоантиоксидантов, так и группой антиперекисных ферментов, и зависит от общего фонда атомов водорода (НАД Н и НАДФ Н). Конечным звеном антирадикальной цепи является основной липидный БАО клеточных мембран – токоферол, а окисленные формы токоферола восстанавливаются аскорбатом и некоторыми другими водорастворимыми БАО. Тиоловые БАО – цистеин или эрготионеин – в ФАС преимущественно выполняют роль восстановителей окисленной формы аскорбата за счет передачи восстановительных эквивалентов от фонда НАД Н + НАДФ Н, хотя, по-видимому, в неклеточных образованиях, в частности в сперме, они могут выполнять функции БАО прямого действия. К БАО непрямого действия относится рибофлавин, являющийся компонентом глутатионредуктазы. Нарушение баланса между воздействием прооксидантных факторов и функциональными возможностями физиологической антиоксидантной системы организма ведет к избыточному неферментному свободнорадикальному окислению. Во-первых, снижается поступление биоантиоксидантов – токоферола, аскорбата, биофлавоноидов, эрготионеина и др. Этот фактор ежегодно проявляется в умеренных и полярных широтах в зимне-весенний период, когда продукты питания человека резко обедняются биоантиоксидантами. Затем стрессы различного происхождения, когда одновременно под влиянием катехоламинов и кортикостероидов в кровь поступает избыток жирных кислот и кислорода; поступление в организм прооксидантов, к числу которых относятся многие пестициды, лекарства-окислители, фотохимические продукты смога и т.д.; избыточное потребление жиров и углеводов при недостаточном расходовании их; гипокинезия с ее низким уровнем биологического ферментативного окисления, т.е. понижением восстановления пиридиннуклеотидов; физические факторы – радиоактивный фон, ультрафиолетовое облучение, электромагнитное поле; возрастное снижение активности антиоксидантных ферментов и их врожденные энзимопатии. Срыв антиоксидантной защиты характеризуется развитием свободнорадикальных повреждений разных компонентов клетки и тканей, составляющих синдром пероксидации и включающий следующие изменения: повреждение мембран; инактивацию или трансформацию ферментов; подавление деления клеток; накопление в клетке инертных продуктов полимеризации. Периодически повторяющийся синдром пероксидации составляет фактор патогенеза ряда заболеваний, что послужило поводом выделения их в группу свободнорадикальных патологий [1]. Накопление активных форм кислорода и других пероксидантов может вызвать так называемый оксидативный (окислительный, или пероксидный) стресс. Выраженный оксидативный стресс повреждает мембраны и клетку в целом, утяжеляет течение многих наиболее распространенных болезней и состояний или даже участвует в их патогенезе. Таких заболеваний описано уже свыше 60, хотя по-прежнему дискутируется вопрос, является ли пероксидный стресс причиной или следствием повреждения тканей. Ключевая роль в защите клетки от оксидативного стресса должна, по-видимому, отводиться системе глутатиона [4]. Действительно, живая клетка использует три линии ферментативной защиты от активных кислородных соединений с помощью супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы; глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы. Эти три линии защиты последовательно восстанавливают супероксидрадикалы, Н2О2 и органические гидроперекиси. Можно добавить еще четвертую линию защиты — обезвреживание вторичных продуктов переокисления других окисленных соединений, в которой участвуют глутатионтрансфераза, глиоксилаза и формальдегиддегидрогеназа. Очевидно, что глутатион участвует в трех линиях защиты из четырех и, следовательно, вносит основной вклад в функционирование антиоксидантной системы. Глутатион, глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза, глутатионредуктаза и НАДФ Н образуют глутатионовую антиоксидантную систему, в которой глутатионредуктаза и НАДФ Н необходимы для восстановления окисленного глутатиона и, следовательно, его рециклирования. Восстановление с помощью глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы гидропероксидов предупреждает прогрессирование пероксидации и появление ее вторичных метаболитов. В обезвреживании вторичных продуктов пероксидации и других окисленных веществ главную роль играют глутатионтрансферазы. Они конъюгируют с глутатионом главные и наиболее токсичные продукты перекисного окисления липидов. Таким образом, глутатионовая антипероксидазная система эффективно защищает клетки от оксидативного стресса, и обычно только при ее недостаточности или истощении возникают серьезные поражения. Разумеется, что с точки зрения опасности развития целого ряда хронических неинфекционных болезней, объединяемых в группу свободнорадикальной патологии, нужно стремиться избегать не только истощения глутатиона, а всего пула биоантиоксидантов, функционирующих в составе физиологической антиоксидантной системы организма.