Регуляции экспрессии генов

Регуляция экспрессии генов - это специфическое взаимодействие определенных веществ (главным образом, белков) с различными участками ДНК, расположенных в области точек (сайтов) начала транскрипции. Такое взаимодействие может оказывать как позитивный, так и негативный эффект на уровень транскрипции.  В целом, регуляция генной экспрессии - это один из путей адаптации организма к изменяющимся условиям окружающей среды.

Регуляция экспрессии генов  у прокариот.   В 1961 г. Жакоб и Моно преложили ставшую теперь классической модель оперона. Они исследовали метаболизм лактозы у кишечной палочки.  Он осуществляется тремя ферментами, которые кодируются 3 структурными генами.  Структурные гены расположены последовательно один за другим и связаны между собой физически. Такое расположение генов позволяет регулировать экспрессию всех трех структурных генов с помощью одного  регуляторного центра. Иными словами,  информация со всех трех структурных генов переписывается в виде одной молекулы РНК,  которая называется полицистронной  мРНК.  Образование полицистронных  мРНК  характерно для прокариотов.

Строение регуляторного   центра.  В  состав  регуляторного центра входит ген,  который постоянно  функционирует. Такая экспрессия  не  подвержена  специфической  регуляции  и называется конститутивной.  Продукт этого гена - белок-  репрессор.  Белок -репрессор  состоит  из 4-х  субъединиц с молекулярной массой 38 тыс Да.  Между этим конститутивным геном и структурными  генами  находятся:  оперативный локус или оператор и промотор. Оператор - это участок ДНК,  длиной в 27 пар оснований.  Промотор -  это участок ДНК, к которому присоединяется РНК-полимераза.     Промотор, оператор и структурные гены называются опероном.

У прокариот наблюдается 2 типа регуляции  генов: позитивная и негативная.  Последовательность негативной регуляции: конститутивный ген постоянно вырабатывает белок-репрессор.  Этот репрессор в отсутствие лактозы садится на оператор и препятствует связыванию РНК - полимеразы с промотором.  В этом случае не происходит синтез полицистронной мРНК.

Если в клетку попадает индуктор (лактоза),  то он связываются с  репрессором,  меняет его конформацию, что приводит к освобождению оператора. Свободный оператор - это сигнал, разрешающий связывание РНК-полимеразы с промотором и начало транскрипции полицистронной мРНК.  Обязательными условиями присоединения РНК - полимеразы является наличие циклического АМФ и белка-активатора катаболитных генов.  Только при их совместном действии РНК- полимераза связывается с промотором. После этого начинается  синтез мРНК.  Особенностью у прокариот является то,  что не дожидаясь окончания синтеза мРНК, начинается синтез белка рибосомами.  Т.е.  лактоза сама индуцирует собственное расщепление.  При снижении  концентрации  лактозы репрессор высвобождается, связывается с оператором и синтез мРНК блокируется.  Такой тип оперона называется индуцибельным.

Другим вариантом  оперона является регуляция конечным продуктом реакции (эффектором).  В этом случае ген-регулятор  определяет  синтез  неактивного  белка-репрессора.  Конечный продукт  реакции связывается с неактивным репрессором и приводит  его  в активное состояние. Репрессор  связывается с оператором и блокирует  тем самым транскрипцию структурных  генов. Это продолжается до тех пор,  пока концентрация эффектора не падает. После этого эффектор отсоединяется  от репрессора, а репрессор инактивируется и работа оперона возобновляется. Такой тип оперона называется репрессивным. Например, так происходит регуляция метаболизма триптофана.

У прокариот соблюдается принцип коллинерности, т.е. размер мРНК соответствует размеру гена.  Регуляция экспрессии  гена  у прокариот происходит только на уровне транскрипции.

Схема строения типичного  гена эукариот.

У эукариот принято выделять две  зоны:  структурную и регуляторную.  Они разделены сайтом начала транскипции. Структурная зона представлена структурным геном.  Ген состоит из кодирующих последовательностей - экзонов и некодирующих последовательностей - интронов. Длина интронов колеблется от 80 до 1000 и более нуклеотидов.  Для интронов не характерна строгая последовательность нуклеотидов.  Интроны ограничены консенсусными областями, строго консервативными.  Это связано с точным механизмом удаления интронов,  так как ошибка в 1 нуклеотид сделает бессмысленной закодированную  информацию.  Количество интронов колеблется от 2 до 50.

     Регуляторная область   состоит из 2-х элементов:  1 элемент  обеспечивает базовый уровень  регуляцию экспрессии  (или   промотор),  2-й  элемент - дополнительный  уровень регуляции экспрессии. Промотор  располагается перед точкой (сайтом) начала транскрипции.  Базовый   уровень  регуляции экспрессии  состоит из 2-х элементов:  ТАТА-бокс  и ЦААТ-бокс. ТАТА-бокс направляет РНК-полимеразу к сайту инициации транскрипции и, следовательно, определяет точность начала  синтеза мРНК.  ЦААТ-бокс  контролирует  частоту транскрипции.    Чтобы РНК-полимераза узнала промотор, необходимо предварительное присоединение ТАТА-фактора - большого белкового комплекса.  ТАТА-бокс и ТАТА-фактор образуют транскрипционный комплекс многоразового использования.     Общее свойство элементов базовой регуляции: они функционируют только  при связывании с ними определенных белковых факторов, которые называются белки-регуляторы. Белки-регуляторы связываются в определенном месте,  которое называется область, лежащая перед промотором. Обычно он представляет собой последовательность ДНК, содержащую 100 нуклеотидных пар.

Предпромоторная область содержит сайты связывания с белками -регуляторами.  Существуют белки-регуляторы, специфичные для клеток данной ткани.  Но также существуют белки-регуляторы, характерные для многих клеток.  Но при  этом  регуляторные  белки взаимодействуют друг с другом и от суммарного знака взаимодействия зависит включен ген или выключен. а также степень его экспрессии.  Эффект совместного действия белков - регуляторов и от их сочетания контролирует активность многих генов.  Но  не  все регуляторные белки равны:  существуют главные белки-регуляторы, которые контролируют работу многих генов.

Белки-регуляторы кодируются  генами,  лежащими  на  той же хромосоме  или на других хромосомах.  В первом случае  регуляция относится к  цис-типу, во втором - к транс-типу.   

Дополнительный уровень регуляции  входят последовательности ДНК двух классов,  которые в 200 раз могут  усиливать или ослаблять базовый  уровень регуляции экспрессии.  Первый класс последовательностей  называются энхансеры,  второй - сайленсеры. Особенностью работы энхансеров и сайленсеров является то,  что они оказывают свое влияние,  находясь на определенном расстоянии от элементов базового уровня.  Это расстояние может быть не  менее 100 нуклеотидов и до нескольких тысяч нуклеотидов. Считается, что действие энхансеров и сайленсеров не опосредовано какими-то специфическими веществами или эффекторами.  Они влияют непосредственно на элементы базовой регуляции.

Кроме того,  существует еще один класс регуляторных последовательностей, которые обеспечивают адаптивную регуляцию  экспрессии некоторых генов. К ним  относятся регуляторные элементы, которые  начинают участвовать в регуляции  в ответ  на  действие: а) гормонов,  б) теплового шока, в) действие металлов, например, кадмия и цинка, г) некоторых  химических токсинов и т.д.

Синтез и процессинг РНК. Синтез РНК- это сложный многоэтапный  процесс,  идущий  с потреблением энергии.  На первом этапе происходит деконденсация хроматина, затем наступает стадии инициации, элонгации и терминации.

Инициация запускается тремя  факторами  инциации  белковой природы. В ходе стадии инициации РНК-полимераза, присоединяясь к промотору, начинает раскручивать цепи ДНК кпереди от себя. Синтез  мРНК  всегда идет на одной из двух цепей ДНК.  мРНК всегда одноцепочечная.  Построение РНК на ДНК происходит  по  принципу комплементарности,  с той лишь разницей,  что вместо тимина используется урацил.  Заканчивается синтез  РНК в терминирующей последовательности.  Эта последовательность называется кодоном терминации трансляции.

Область транскрибируемой  ДНК,  лежащей между промотором и терминатором, называется единицей транскрипции или  транскриптоном.  Образующаяся  РНК называется первичным транскриптатом.  У прокариот первичный транскриптат обычно содержит РНК-копии нескольких генов, у эукариот - только одного.

Существует несколько типов  РНК-полимераз,  в процессе синтеза РНК участвует РНК-полимераза II.  Первоначально синтезируется 5 - конец РНК-транскриптата,  который сразу кэпируется. Функция кэпирования  - это защита РНК-транскриптата от разрушения, а также с помощью кэпа РНК связывается с рибосомой.

Кэпирование -  это присоединение определенной последовательности нуклеотидов. С нее начинается на рибосоме трансляция, затем кэп удаляется.      Стадия элонгации или удлинения РНК-транскриптата. Во время этой стадии происходит дальнейшее расплетание ДНК и разрушение нуклеосом. Скорость синтеза - 30 нуклеотидов в секунду. Элонгация контролируется специальными  факторами элонгации белковой природы. Стадия терминации:  завершение  синтеза РНК-транскриптата происходит в стоп-кодоне вследствие присоединения факторов терминации белковой природы. При этом к 3-концу транскриптата присоединяются от 100 до 200 остатков адениловой кислоты,  которые образуют polyA - хвост.  Считается, что poly-А-хвост предотвращает деградацию  РНК-транскриптата и облегчает его транспорт в цитоплазму. Первичные РНК-транскриптаты  могут либо хранится в нуклеоплазме, либо подвергаться сплайсингу.

Ген - это сложная функционально  активная единица, предназначенная  для регулируемого синтеза молекулы РНК.

                Сплайсинг РНК.    В этом случае к первичным РНК-транскриптатам присоединяются частицы,  которые называются гетерогенными ядерными нуклеопротеиновыми частицами (гя-РНП-частицы).  Они представляют собой РНК длиной 5000  нуклеотидов,  намотанную  на  белковый  остов. Гя-РНП-частицы  присоединяются  в местах  соединения экзонов и интронов,  затем попарно объединяются с образованием  агрегатов или сплайсосом.  Кроме того,  в состав сплайсосомы входят малые ядерные РНК, функция которых - удаление интронов.

Механизм удаления интронов происходит с высокой точностью. В процессе сплайсинга РНК образуется специфичная лассо-образная структура,  которая приводи к высвобождению интронов и сшиванию экзонов. Итак,  после процессинга и сплайсинга РНК-транскриптат содержит: кэпирующую последовательность,  кодон инициации (AUG) - метионин,  экзоны, стоп-кодон и полиА-конец. Такая мРНК-выходит в цитоплазму и используется в процессе синтеза белка.

Альтернативный сплайсинг.  Механизм и регуляция неизучены. Суть альтернативного сплайсинга - из одного и того же первичного транскриптата можно получить разные м-РНК путем сшивания экзонов в разной последовательности.  Считается, что альтернативный сплайсинг очень распространен.  Так,  один первичный транскриптат в зависимости от числа экзонов может нести информацию от 4 до 1000 генов. Другим доказательством является то, что молекул РНК в ядре мало - 2 процента,  в цитоплазме можно обнаружить 145 тыс. видов мРНК.

Синтез тРНК и рРНК.  тРНК- у прокариот и эукариот синтезируются в виде больших предшественников, которые затем подвергаются нуклеолитическому процессингу при участии рибонуклеаз, так как гены тРНК содержат единичные интроны. После сплайсинга формируется пространственная структура,  содержащяя 2 функциональные части:  триплет антикодона и аминоацильный конец. В клетках находятся 20 видов тРНК,  по числу аминокислот, входящих в состав белка.

Гены рРНК располагаются в ядрышке.  Молекулы рРНК первоначально транскрибируются в виде большого первичного транскриптата. Этот транскриптат подвергается нуклеолитическому процессингу, отличающегося  от  процессинга тРНК механизмом и сигналами. Сразу по окончанию процессинга рРНК связывается с белками и образуют большую и малую субъединицу рибосом.

          Уровни регуляции экспрессии  генов у эукариот.    Регуляция экспрессии генов у эукариот идет на разных уровнях и в разных компартментах. В ядре экспрессия генов регулируется на уровнях генных  перестроек,  амплификации,  структурных перестроек хроматина,  транскрипции и процессинга. В цитоплазме контроль осуществляется на уровне трансляции и пострансляции.

Контроль на уровне транскрипции зависит  от  действия  белков-регуляторов, энхансеров и сайленсеров и элементов адаптивной регуляции. Контроль на уровне процессинга РНК.  Процессинг бывает 2-х типов: альтернативный и дифференциальный.  Альтернативный  процессинг -   это   механизм,  определяющий  какой из  первичных РНК-транскриптатов будет подвергнут сплайсингу.  Дифференциальный процессинг РНК заключается в том,  что из общего транскриптата образуются различные молекулы РНК. Это определяется различиями в выборе сайтов полиаденилования. С дифференциальным процессингом тесно связан механизм альтернативного сплайсинга.      Контроль на уровне трансляции: скорость деградации мРНК.

Синтез белка.   мРНК представляет собой последовательность нуклеотидов: A, U, G, C. Их можно сравнить с 4-х буквенным алфавитом. Сочетание трех  букв  или трех нуклеотидов (триплет) называется кодоном.  К месту синтеза белка аминокислоты доставляются транспортными РНК. Синтез белка начинается  с образования комплекса рибосома-мРНК. Рибосома содержит 2 функциональных участка: пептидильный (Р) и аминоацильный (А).  В аминоацильном  участке происходит узнавание кодонов. В пептидильном участке содержится растущая цепь.      Этапы синтеза белка:  инициация,  элонгация и терминация.

Инициация включает в себя узнавание, при котором кодону на мРНК соответствует антикодон тРНК,  затем происходит  транслокация тРНК  с аминокислотой в Р-центр,  присоединение аминокислоты и высвобождение тРНК.  При этом мРНК смещается относительно рибосомы  на  один  кодон.  На стадии элонгации процесс повторяется снова, с той лишь разницей, что каждая последующая аминокислота присоединяется  к предыдущей  с образованием пептидной связи. Этот процесс протекает с энерготратами в виде АТФ. Одна рибосома за 1 минуту осуществляет синтез 100 пептидных связей. Стадия терминации начинается,  когда в А центре появляется нонсенс-кодон. Этот  нонсенс-кодон узнается факторами высвобождения и отсоединяет молекулу белка от рибосомы.  В целом, процесс синтеза белка регулируется и контролируется 9 факторами белковой природы: по 3 фактора инициации, элонгации и терминации. После окончания синтеза, белок попадает в полость эндоплазматического ретикулума, приобретает вторичную, третичную структуру, подвергается процессингу,   может использоваться  в жизнедеятельности клетки, складироваться или секретироваться наружу путем экзоцитоза.