Принципы ДНК-наноархитектоники: вопросы применения

Министерства Образования  и Науки Российской Федерации

ФГАОУ ВПО «СКФУ»

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

на тему: «Принципы ДНК-наноархитектоники: вопросы применения»

 

 

 

 

 

 

Выполнил: студент 4-го курса

группы НЭ-091

Лысенко А.С.

Проверил: к.м.н., доцент

Будкевич Е.В.

 

 

 

Ставрополь, 2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ                                                                                                             2

Перспективы практического применения ДНК-наноконструкций            6

Методы исследования структуры  ДНК-нанообъектов                            13

ЗАКЛЮЧЕНИЕ                                                                                           16

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ                                                   17

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Принцип комплементарности Уотсона-Крика, на котором основано взаимодействие молекул нуклеиновых кислот, определяет их интенсивное использование в разнообразных молекулярно-биологических приложениях, связанных с образованием стабильных и сиквенс-специфичных комплексов, таких как полимеразная цепная реакция, гибридизационный анализ, антисенс-подходы и других. Программируемая самоорганизация многокомпонентных комплексов ДНК, направление которой задается при выборе нуклеотидных последовательностей составных частей, послужила основным стимулом к появлению кардинально новой области применения нуклеиновых кислот — структурной ДНК-нанотехнологии, или ДНК-архитектоники. Работы в данной области направлены на создание структур определенной формы и пространственной организации с использованием молекул ДНК в качестве строительных элементов с программируемой способностью к самоассоциации.

Молекулы ДНК являются уникальным объектом для получения наноконструкций по ряду причин:

• параметры структуры различных комплексов на основе ДНК-цепей (дуплексы, триплексы, квадруплексы и т.д.) известны и являются величинами нанометрового диапазона;
• разработаны и автоматизированы методы синтеза немодифицированных (нативных) молекул нуклеиновых кислот и их производных;
• детально изучена термостабильность ДНК-комплексов в зависимости от нуклеотидной последовательности и различных внешних факторов (природы катионов, НК-специфичных лигандов, сорастворителей и т.д.), определены основные принципы процесса самоассоциации ДНК-нитей, что важно для программирования формы получаемых ДНК-объектов и снижения эффективности образования побочных продуктов;
• разработаны методики введения различных модифицирующих компонентов в любую заданную позицию молекулы ДНК с сохранением ее способности к специфическим взаимодействиям, что может быть использовано для повышения функциональности ДНК-структур;
• открыты и описаны функции многих ДНК-зависимых ферментов, использование которых может быть полезно как при конструировании ДНК-объектов (например, использование ДНК-лигаз для сшивания «строительных блоков» в более сложно организованные структуры), так и при доказательстве их структуры и удалении побочных продуктов (например, нуклеазы);
• созданные на основе биологических молекул объекты обладают рядом уникальных свойств (биосовместимость и биодеградация), что открывает перспективы для их практического применения в биологии, медицине и др.

Первоначально ДНК-нанотехнология основывалась на использовании в качестве «строительных блоков» нативных олигонуклеотидов и ДНК-дуплексов. Конструирование на основе исключительно нативных НК накладывает некоторые ограничения на форму получаемых объектов, поскольку двухцепочечная молекула (дцДНК) — жесткая, топологически линейная структура. Персистентная длина ДНК-полимера в зависимости от состава и ионной силы буферных растворов составляет ~ 25-100 нм.¹ Очевидно, что линейные молекулы ДНК не представляют особого интереса для организации разнообразных дву- и трехмерных объектов. Поэтому в качестве «строительных блоков» все чаще рассматривают ДНК-дуплексы, содержащие в своем составе дополнительные модифицированные элементы, которые придают молекулам дцДНК недостающую им гибкость.

В структурной ДНК-нанотехнологии можно выделить два основных направления — это конструирование статических нано- и микрообъектов и создание динамических структур (молекулярных машин), способных контролируемо изменять свою форму и особенности организации. По структуре статические ДНК-объекты классифицируют на дискретные (обособленные структуры фиксированного размера) и периодические протяженные структуры, сформированные в результате последовательного соединения одного и того же или нескольких мономерных блоков.

За последнее десятилетие опубликовано большое число оригинальных и  обзорных статей, освещающих многие аспекты  конструирования объектов на основе ДНК². В большинстве обзоров уделяется внимание лишь отдельным этапам построения ДНК-структур. В ряде работ представлены мономерные элементы, используемые в ДНК-наноархитектонике для формирования сложных ДНК-объектов; описаны полученные к настоящему времени дискретные и периодические статические ДНК-объекты, а также динамические молекулярные ДНК-машины; продемонстрированы примеры введения модифицированных остатков ненуклеотидной природы, позволяющие повысить как структурное, так и функциональное разнообразие ДНК-объектов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ДНК-НАНОТЕХНОЛОГИЙ

 

Несмотря на огромное разнообразие получаемых ДНК-наноструктур, большинство из них до сих пор служат решению демонстрационных задач, в том числе связанных с проявлением эстетических вкусов авторов. В литературе главным образом обсуждаются лишь перспективы практического применения ДНК-конструкций. Наибольший потенциал их применения, по мнению многих авторов, связан с возможностью получения гибридных конструкций, несущих помимо элементов на основе ДНК компоненты ненуклеотидной природы. Важной особенностью такого декорирования ДНК-структур является возможность размещения функциональных групп и элементов в строго заданных позициях относительно друг друга и поверхности самой структуры в целом. На настоящий момент предложено множество разнообразных способов модифицирования ДНК-объектов катионами металлов, наночастицами, квантовыми точками, белками и др.

Можно выделить несколько перспективных  направлений использования модифицированных ДНК-конструкций. Одно из них связано  с декорированием молекул ДНК  ионами или наночастицами металлов, т.е. с созданием ДНК-нанопроводов. Металлизация цепи ДНК была проведена в два этапа: молекулу ДНК фиксировали концами на двух золотых электродах; противоионы Na ⁺ , компенсирующие заряд ДНК, заменяли на Ag ⁺ , после чего НК-цепь полностью покрывали металлическим серебром в кислом растворе гидрохинона в условиях тусклого освещения.³ В дальнейшем металлизированные ДНК-фрагменты получали при обработке модифицированной ДНК, несущей альдегидные группировки, раствором AgNO₃ или реактивом Толленса (аммиачный раствор оксида серебра) с последующей обработкой AuSCN в гидрохиноне. Такие процедуры приводят к образованию НК-провода, полностью покрытого золотом.⁴ С помощью аналогичной методики проведена металлизация нуклеино-белковой нити (ДНК-RecA) и периодической ДНК-решетки. Длина нанопроводов, получаемых на основе ДНК, составляет несколько микрометров, диаметр ~ 50-100 нм.

Предложен и другой способ металлизации НК-аналогов, который заключается в создании правозакрученной спирали двумя цепями НК-подобных молекул вокруг центральной оси, сформированной из ионов металлов. В основе методики лежит способность катионов металлов образовывать координационные соединения (комплексы). Например, ионы Cu²⁺ и Hg²⁺ способны давать стабильные комплексы с двумя молекулами 3-гидрокси-2-метилпиридин-4(1H)-она и пиридина соответственно. Аналоги нуклеиновых кислот, содержащие вместо гетероциклических оснований один из таких лигандов или их комбинацию, при введении в раствор Cu²⁺ и (или) Hg²⁺ образуют модифицированный ДНК-дуплекс вокруг оси, насыщенной ионами металлов. Вместо водородных связей такой дуплекс стабилизируется благодаря координационным взаимодействиям.⁵   Потенциальное применение ДНК-наноконструкций связывают с возможностью размещения на их поверхности различных биомолекул — НК-фрагментов или белков. Способы введения подобных компонентов основаны на использовании комплементарного распознавания, специфических взаимодействий антиген-антитело или биотин-стрептавидин, НК-аптамеров, а также на формировании ковалентных сшивок с помощью бифункциональных линкеров. Двумерные ДНК-плитки с размещенными на них в строгом порядке фрагментами НК могут быть использованы в качестве наноразмерных аналогов ДНК-чипов. Была получена ДНК-плитка размерами 90х60 нм, содержащая в определенных позициях поверхности олигонуклеотидные фрагменты, соответствующие трем генам — Rag-1, c-myc, β-actin. Добавление в раствор соответствующих РНК-мишеней, комплементарных данным участкам генов, приводит к формированию гибридизационных комплексов, которые можно детектировать с помощью анализа поверхности ДНК-плитки методом атомно-силовой микроскопии.⁶ Отмечаются некоторые ограничения в использовании подобных ДНК-чипов. Наиболее значимое из них — высокая плотность размещения специфических зон на поверхности наночипа с большим количеством НК-зондов. Например, было отмечено, что стерические препятствия и электростатические отталкивания НК-фрагментов на поверхности плитки могут снижать эффективность захвата мишени НК-зондами, располагающимися ближе к центру сенсорной конструкции.

На основе периодической ДНК-решетки  был получен ДНК-чип для одновременного детектирования нуклеиновых кислот, белков и других органических молекул  в многокомпонентных системах.⁷ ДНК-Чип был сконструирован на основе трех блоков: блоки А1 и А2 были модифицированы органическими красителями Су5 и Red-X соответственно, блок B содержал одноцепочечный участок-сенсор, образующий сигнальный комплекс с комплементарным олигонуклеотидом, меченным флуоресцентным красителем Fluor 488. Данный участок в свободном состоянии представляет собой зонд, специфично взаимодействующий с белком либо органической молекулой или же комплементарный определенному участку гена. При добавлении к ДНК-чипу соответствующих молекул-мишеней формируется комплекс, а сигнальный олигонуклеотид, содержащий флуорофор, вытесняется. Наличие выявляемых молекул детектируется по снижению интенсивности флуоресценции специфических зон чипа. Возможность выявления сразу нескольких мишеней была реализована с помощью двух типов красителей, присоединенных к блокам А1 и А2. При сборке ДНК-чипа составные блоки смешиваются в соотношении (А1 + А2): В = 1:1, однако построение непосредственно ДНК-чипа для выявления нескольких типов молекул осуществляется на основе нескольких мономерных ДНК-решеток, каждая из которых содержит блоки А1 и А2, взятые в строго определенном соотношении, и специфические блоки В-типа, несущие заданный зонд. Следовательно, ДНК-решетки для выявления разных молекул имеют характерную отличающуюся окраску, изменяющуюся определенным образом при формировании комплекса зонд-мишень. Количество выявляемых мишеней в одной системе определяется чувствительностью флуоресцентного детектора. Данная концепция была протестирована для выявления четырех резко различающихся по типу мишеней: ДНК двух вирусов (вируса иммунодефицита человека и вируса тяжелого острого респираторного синдрома), белка a-тромбина человека и аденозинтрифосфата.

Размещение на поверхности одной  ДНК-структуры разных белковых молекул открывает перспективы получения так называемых нанофабрик. Возможность сближения на ДНК-плитке нескольких участвующих в серии последовательных превращений ферментов может привести к ускорению мультиферментных реакций, лимитирующей стадией которых является диффузия субстратов.⁸ На молекуле ДНК с использованием высокоспецифичного биотин-стрептавидиного взаимодействия фиксировали ферменты оксидоредуктазу и люциферазу, катализирующие две сопряженные реакции. Эффективность превращения субстрата в таком комплексе была, по крайней мере, в два раза выше, чем в случае одновременного присутствия таких ферментов в растворе. Ведь даже простое сближение в пространстве двух и более органических молекул, используя присоединенные к ним комплементарные олигонуклеотиды, может приводить к ускорению реакции между реагентами за счет изменения характера реакции на псевдовнутримолекулярный.⁹

Особые надежды в получении  нанофабрик связывают с внедрением в качестве платформы для их построения структуры типа ДНК-оригами. В этих мультимолекулярных ассоциатах имеется возможность модифицировать большое число формирующих их компонентов, при этом функционализация определенного компонента задает позицию данной функции на поверхности формируемой конструкции, а также взаимное расположение функций.

Трехмерные ДНК-структуры (ДНК-многогранники  и оригами-коробочки) рассматриваются  в качестве возможных кандидатов для капсулирования и транспортировки разнообразных молекул — разработаны способы упаковки внутри подобных структур молекул белков или наночастиц.¹⁰ Важной особенностью подобных ДНК-объектов является то, что, с одной стороны, они обладают структурной стабильностью, с другой — могут быть открыты за счет биодеградации стенок при воздействии нуклеаз или в присутствии в растворе специфических сигнальных молекул.¹¹

Было продемонстрировано конструирование  ДНК-тетраэдра, форма которого изменяется в ответ на присутствие в растворе определенной нуклеотидной последовательности. Для этого в одно из его ребер  вводят петлю, раскрывающуюся и формирующую  комплементарный комплекс при добавлении в систему соответствующего олигонуклеотида. В результате при увеличении одного из ребер ДНК-многогранника увеличивается площадь одной из его граней, что может приводить к высвобождению молекул, переносимых внутри подобного ДНК-контейнера. Была разработана технология конструирования по принципу оригами ДНК-контейнера, оборудованного «замком», открывающимся в ответ на присутствие в системе олигонуклеотидного «ключа».¹² Таким образом, трехмерные ДНК-структуры могут быть использованы для защиты и транспортировки специфических молекул, в том числе адресованных внутрь клеток.

Возможность организации молекул  строго определенным образом на поверхности ДНК-объекта может быть использована для исследования их свойств. Например, расположив наночастицы металлов на ДНК-решетке, где четко задается расстояние между модифицированными сайтами, можно исследовать их оптические, электронные и каталитические характеристики. Уникальная форма ДНК-нанотрубок позволяет применять их для своего рода упаковки и последующего структурного исследования с помощью спектроскопии ЯМР трансмембранных белков.¹³

На примере молекулы ДНК и  двумерной ДНК-решетки показана возможность использования структур на основе ДНК в качестве матриц для молекулярной литографии. Для  этого нанесенные на поверхность  слюды ДНК-объекты покрывали золотой  пленкой толщиной в 20 нм, затем металлическую пленку приклеивали к стеклянной пластинке. После разделения такой сэндвич-структуры на внешней поверхности золотой пленки, оставшейся на стекле, наблюдали негативное изображение ДНК-решетки, сформированной изначально на слюде.